[發明專利]一種蛋白質甲基化的分析處理方法及其應用

在審

• 申請號: 201611006806.7
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN108072555A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 葉明亮;王科云
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N30/96
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種蛋白質甲基化的分析處理方法，其特征在于：

(1)利用重標甲硫氨酸細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術將蛋白質中的賴氨酸和精氨酸上的甲基化修飾基團進行重標標記；

(2)對步驟(1)得到的重甲基化修飾后的蛋白質進行多酶酶切處理，所述多酶為胰蛋白酶、賴氨酸酶和精氨酸酶；

(3)對步驟(2)得到的蛋白質酶解液進行離心輔助的基于強陽離子交換微柱(SCXtip)的甲基化肽段分離，微柱分離時，清洗劑為78％-82％乙腈，勃-羅二氏緩沖溶液(Britton&Robinson Universal Buffer，BRUB)，清洗劑pH值為8.5-9.5，以降低組氨酸肽段的干擾，得到甲基化蛋白質組。

2.根據權利要求1所述的分析處理方法，其特征在于：

步驟(1)具體操作為，將細胞在含有重標甲硫氨酸的DMEM培養液中培養，得到的細胞于裂解液中超聲輔助破碎。

3.根據權利要求1所述的分析處理方法，其特征在于：

所述勃-羅二氏緩沖溶液包括磷酸、硼酸和醋酸，勃-羅二氏緩沖溶液用氫氧化鈉溶液調節pH值；

所述多酶酶切處理是指向重甲基化修飾后的蛋白質中加入胰蛋白酶、賴氨酸酶和精氨酸酶進行酶解。

4.根據權利要求2所述的分析處理方法，其特征在于：

所述細胞培養的體系是含有0.2mM的L-Methionine-(methyl-13C,D3)的DMEM培養基，并加入10％的透析處理的胎牛血清；

所述細胞裂解液的體系是含有8M尿素，1％v/v聚乙二醇辛基苯基醚，65mM二硫蘇糖醇，1mM苯甲基磺酰氟，1％v/v蛋白酶抑制劑，50mM Tris-ClpH 7.5的緩沖溶液。

5.根據權利要求1所述的分析處理方法，其特征在于：

步驟(2)中多酶酶切處理的操作步驟為：向重甲基化修飾后的蛋白質中加入終濃度為10-20mM二硫蘇糖醇，37-60℃水浴中1-3h，然后加入終濃度為20-40mM碘代乙酰胺，20-25℃避光反應40-60min，通過超濾輔助酶解策略將溶液置換為50mM碳酸氫銨，pH 8.0，按照蛋白：酶質量比為50:1加入胰蛋白酶(trypsin)和賴氨酸酶(lys-C)，在37℃條件下酶解16小時，經超濾處理去除胰蛋白酶(trypsin)和賴氨酸酶(lys-C)，然后添加10×活化溶液至1×，按照蛋白：酶質量比為50:1加入精氨酸酶(arg-C)，在37℃條件下酶解16小時，其中活化溶液為50mM pH 7.6–7.9Tris-HCl，50mM二硫蘇糖醇(DTT)和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

6.根據權利要求3所述的分析處理方法，其特征在于：

所述氫氧化鈉溶液用氫氧化鈉溶解于水中制成；BRUB溶液的濃度為5mM，包括5mM磷酸、5mM硼酸和5mM醋酸，用1M氫氧化鈉溶液調pH值至8.5-9.5。

7.根據權利要求1所述的分析處理方法，其特征在于：

步驟(3)中所述離心輔助中離心機的離心力為1000g-3000g；強陽離子交換微柱(SCXtip)為填充了強陽離子交換色譜材料的以脫脂棉為塞板的槍頭。

8.根據權利要求1所述的分析處理方法，其特征在于：

步驟(3)具體操作為：將步驟(2)中得到的蛋白質上樣到SCXtip中，利用200μL清洗液洗2-5次，所述清洗液為78％-82％乙腈，勃-羅二氏緩沖劑，pH 8.5-9.5，以降低組氨酸肽段的干擾，再分別利用200μL的一系列洗脫溶液來洗脫結合的甲基化多肽，洗脫溶液分別為60％乙腈，5mM勃-羅二氏緩沖劑，pH 9；60％乙腈，5mM勃-羅二氏緩沖劑，pH 10；60％乙腈，5mM勃-羅二氏緩沖劑，pH 11；30％乙腈，5mM勃-羅二氏緩沖劑，pH 12；5mM勃-羅二氏緩沖劑，pH12，1M氯化鈉；分別收集各洗脫餾分并進行除鹽處理，將所得甲基化肽段室溫下凍干，得處理后的甲基化蛋白質組。