[發明專利]一種脊尾白蝦胚胎顯微注射方法及利用方法構建mRNA過表達模型

在審

• 申請號: 201611006768.5
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN108070617A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 張繼泉;宋鳳閣;桂天書;相建海
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/873;A01K67/033
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎;周秀梅

本發明屬于基因編輯技術領域，具體說一種脊尾白蝦胚胎顯微注射方法及利用該方法構建mRNA過表達模型。在高滲透壓的顯微注射體系及特定的顯微注射條件下向脊尾白蝦單細胞期胚胎進行顯微注射。以體外轉錄mRNA作為注射材料，采用所述脊尾白蝦胚胎顯微注射方法，構建過表達mRNA的脊尾白蝦模型。利用本發明成功實現了體外轉錄EGFPmRNA在脊尾白蝦胚胎中的表達。脊尾白蝦胚胎顯微注射方法的建立及其在構建mRNA過表達模型中的應用，對于開展蝦類等甲殼動物功能基因的研究及其基因編輯都具有重要理論意義和實踐意義。

技術領域

本發明屬于基因編輯技術領域，具體說一種脊尾白蝦胚胎顯微注射方法及利用該方法構建mRNA過表達模型。

背景技術

海水養殖業是藍色農業的重要組成部分。如何獲得更多更優質的海水養殖品種一直是國內外科學家致力于研究的重要內容。同時，社會經濟的發展，對產品多樣化的需求也對海洋生物種質改良提出了更高要求。以對蝦為例，對蝦是我國海水養殖的重要品種，在海洋漁業中占有重要地位。我國科學家通過傳統選育的方法，已育出了中國對蝦“黃海1號”、“黃海2號”，凡納濱對蝦“科海1號”等新品種，而且部分新品種已實現產業化。但常規選育方法周期長、見效慢；近年來發展起來的依靠生產性狀關鍵基因的定向、快捷的分子育種技術將是生物制種未來的發展方向。目前，對蝦全基因組測序工作也在進行中，大量的對蝦功能基因已經和正在被發掘出來，深入分析這些基因的功能從而闡明其與生產性狀的關系，可以為育種關鍵基因的選擇與評價提供可靠依據。盡管生物信息學可以對基因功能進行預測，但是受到細胞系及轉基因技術瓶頸的限制，蝦類功能基因的實驗生物學研究也僅僅停留在基因水平(基因表達圖示技術、定量技術、基因定位等)和蛋白水平(體外重組表達、Western blot、免疫組織化學、蛋白-蛋白相互作用以及蛋白-DNA相互作用等)上。

轉基因技術則是基因功能驗證技術體系中非常重要的一環，而且也屬于新型的現代分子育種技術。而胚胎的顯微注射是轉基因研究中的重要實驗操作。通過顯微注射的方式，可以將一系列的外源物質導入到細胞或胚胎中；通過顯微注射的方式，也可以對胚胎進行基因敲減與基因編輯從而對功能基因等進行研究。然而，對于蝦類等十足目生物，其功能基因的研究手段相當匱乏。這使得顯微注射技術在蝦類胚胎中的應用顯得尤為關鍵。

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)，屬于甲殼動物亞門十足目(Decapoda)，是一種經濟價值較高的海產蝦類。脊尾白蝦對環境適應性強，易于人工飼養。同時，其繁殖能力強，雌蝦可連續產卵。根據以上優點，脊尾白蝦E.carinicauda可作為新的甲殼動物研究模型，尤其是針對十足目這一經濟甲殼物種，用于揭示這一類物種發育、生長、代謝與繁殖等生命活動規律。但是該蝦類一直缺乏有效的外源物質導入平臺，所以脊尾白蝦胚胎顯微注射平臺的構建具有重要意義。

另外，綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)，是一種在藍色到紫外線波長范圍光線下，能被激發出綠色熒光的蛋白。因為EGFP這一光學特性也使得其經常被作為一個報告基因應用于生物的細胞學與分子生物學等研究中。

發明內容

本發明目的在于解決甲殼動物基因編輯研究匱乏的問題，提供一種脊尾白蝦胚胎顯微注射方法及其利用方法構建體外轉錄模型。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種脊尾白蝦胚胎顯微注射方法，將高滲透壓的顯微注射體系在特定的顯微注射條件下向脊尾白蝦單細胞時期(8細胞之前)胚胎進行顯微注射。

所述高滲透壓的顯微注射體系為顯微注射緩沖液和顯微注射液其中，顯微注射緩沖液：無酶水配制的終濃度為100mM HEPES和1.5M NaCl溶液；

顯微注射液為注射材料和指示劑；其中，注射材料為經無酶水稀釋的體外轉錄EGFP mRNA，mRNA稀釋至400ng/μL；指示劑為酚紅溶液。