[發明專利]一種用于微囊藻毒素檢測的微流控芯片及檢測方法

在審

• 申請號: 201611005361.0
• 申請日: 2016-11-15
• 公開（公告）號: CN108067311A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 崔海松;湯杰;魏峰;鄒曉麗
• 申請（專利權）人: 杭州綠潔水務科技股份有限公司
• 主分類號: B01L3/00
• 分類號: B01L3/00;G01N21/78
• 代理公司: 中國商標專利事務所有限公司 11234
• 代理人: 宋義興

1.一種用于微囊藻毒素檢測的微流控芯片，包括有機玻璃制成的基片和蓋片，所述蓋片熱鍵合于所述基片上，其特征在于，所述基片上刻有微流路，所述微流路依次包括試劑1入口、混合通道、試劑2入口、反應通道、檢測通道和廢液出口，所述試劑1入口包括待測水樣入口、辣根過氧化氫酶標記的微囊藻毒素溶液入口和PBS溶液入口，所述試劑2入口包括十二烷基磺酸鈉入口、酶反應底物入口、牛血清蛋白入口、二抗入口和微囊藻毒素抗體溶液入口，所述混合通道和所述反應通道為蛇形曲折狀，所述反應通道內表面經過化學改性并固定有微囊藻毒素抗原。

2.如權利要求1所述的用于微囊藻毒素檢測的微流控芯片，其特征在于，所述基片微流路采用光刻方法，包括如下步驟：

(1)玻璃基片的表面處理：將基片放入濃硫酸中煮沸30分鐘，沖水后將其放入異丙醇與丙酮為1:1的混合溶液中浸泡10分鐘，然后在乙醇中超聲處理10分鐘，去離子水沖洗后氮氣吹干，放入烘箱中150℃烘1小時；

(2)涂膠：將負膠RFJ-220經旋涂機甩涂，涂膠轉速為1000rpm，30秒后，膠厚為5μm；將基片放在熱板上前烘6分鐘，蒸發掉光刻膠中殘留的溶劑；

(3)曝光及顯影：對基片進行紫外曝光，曝光能量為18.9MJ/cm2，曝光時間為9秒；曝光后的玻璃基片用顯影液顯影2分鐘，待顯影液自然晾干后，150℃堅膜35分鐘；

(4)掃底膠：將玻璃基片放入等離子去膠機中2分鐘進行掃底膠，去除顯影后表面殘留的光刻膠；

(5)刻蝕：在室溫下進行，腐蝕液為添加10％HCl的不同程度稀釋的緩沖氧化刻蝕液，每刻蝕20分鐘后堅膜10分鐘，繼續刻蝕；刻蝕完成后，用發煙硝酸去除光刻膠。

3.如權利要求1所述的用于微囊藻毒素檢測的微流控芯片，其特征在于，所述基片和所述蓋片的熱鍵合包括如下步驟：

(1)表面親和處理：基片表面用去離子水、丙酮和無水乙醇混合溶液、去離子水依次清洗，再用稀HF酸漂洗后去離子水沖洗，再用體積比1：1的氨水：雙氧水清洗，最后用去離子水沖洗；

(2)預鍵合：在無超凈環境下，將基片和未玷污的新蓋片在超純水環境中對準貼合后，使基片和蓋片緊密貼合在一起而無相互滑動，取出放進真空干燥箱，干燥1h；

(3)高溫鍵合：將預鍵合后的基片和蓋片平放在高溫爐中，在基片和蓋片上下方各放一塊拋光過的石墨板，上面的石墨板上再壓一塊不銹鋼；高溫爐升溫速度為10℃/min，選擇在620℃保溫一段時間，再以10℃/min降溫至室溫。

4.如權利要求1所述的用于微囊藻毒素檢測的微流控芯片，其特征在于，所述化學改性包括如下步驟：

(1)清洗：基片所述反應通道中先用體積比為1:1甲醇和鹽酸的混合液超聲清洗30min，去離子水清洗后吹干；

(2)基片活化：將體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水的混合液通入到芯片通道內，80℃左右煮40min；

(3)反應結束用去離子水沖洗，再用氮氣吹干芯片；

(4)硅烷化：在氮氣保護下，將體積比為1:9的3-氨丙基三乙氧基硅烷和丙酮的混合液通入反應通道，50℃反應24h，自然冷卻后，用去離子水清洗后60℃干燥2h，將含有過量戊二醛的磷酸緩沖液通入反應通道內，4℃反應1h，20℃反應1h，反應結束后用去離子水沖洗干凈。

5.如權利要求1所述的用于微囊藻毒素檢測的微流控芯片，其特征在于，微囊藻毒素抗原固定包括如下步驟：

(1)將200μL的BSA用400μL硼酸鈉進行清洗兩次，硼酸鈉溶液濃度為50mM，pH＝8-8.2；然后用PBS磷酸鹽緩沖液清洗；

(2)將清洗后的BSA通入反應通道并充滿，室溫下靜置反應45分鐘，然后用PBS磷酸鹽緩沖液清洗反應通道，氮氣吹干；

(3)將過量10倍的二抗溶解到硼酸鈉溶液中，注入反應通道中，室溫浸沒45分鐘，然后去除多余的液體；然后用PBS磷酸鹽緩沖液清洗；

(4)將5μL 50％戊二醛加入到反應通道中，室溫下反應1小時；然后用PBS磷酸鹽緩沖液清洗；

(5)最后用1M NaCl、0.1M甘氨酸、純水、PBS磷酸鹽緩沖液依次進行清洗。