[發明專利]毛細管電泳結合UPLC-MS分析PQQ對兒茶酚胺神經遞質調節作用的研究方法

有效

• 申請號: 201611002722.6
• 申請日: 2016-11-15
• 公開（公告）號: CN106706746B
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 周杏琴;顧曉波;徐希杰;毛師師;欽曉峰
• 申請（專利權）人: 江蘇省原子醫學研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N30/02
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

1.一種毛細管電泳結合UPLC-MS分析PQQ對兒茶酚胺神經遞質調節作用的研究方法，其特征在于步驟為：

（1）毛細管選擇及預處理：

選用未涂層的42cm×50μm石英毛細管柱；新毛細管先依次用甲醇沖洗10min，去離子水沖洗5min，1mol/L NaOH溶液沖洗30min，去離子水沖洗5min，最后再用運行緩沖液沖洗15min；每次進樣前，用去離子水及運行緩沖液各沖洗2min；

運行緩沖液及樣品溶液均用0.22μm微孔針頭過濾器過濾；運行緩沖液當日配制；運行緩沖液為：40mmol/L 四硼酸鈉溶液，pH=9.0；

（2）毛細管電泳分析條件：

檢測波長是260nm，進樣方式為壓力進樣20psi、5.0 s，分離電壓為25kv，毛細管柱溫25℃，二極管陣列PDA檢測器檢測；

UPLC-MS分析條件：UPLC型號 AcQuity H uplc＠,質譜檢測器SQ Detector 2，柱子ACQUiTY UPLC＠BEH C18，色譜條件：流動相A：H₂O+0.1%TFA，B：CH₃OH，梯度洗脫，B/A體積比5/95為5min，75/25為25min，m/z：50-800，流速：0.3mL/min；

（3）緩沖體系和緩沖液濃度的選擇

選擇硼酸緩沖體系進行實驗，分別配制四硼酸鈉濃度為20、30、40、50、60 mmol/L進行試驗，結果發現，選擇40 mmol/L時基線平滑、分離度相對較好且有合適的保留時間；

（4）pH值的影響

選擇40 mmol/L四硼酸鈉緩沖溶液試驗，結果發現當pH為 9.0時，峰型較好，分離效果也較好，因此，選擇40 mmol/L、pH9.0的四硼酸鈉緩沖溶液為合適；

（5）電壓的選擇

選擇25kv較為理想；

（6）PQQ與NE、E反應液的分離檢測及UPLC-MS鑒別

稱取一定量的PQQ、NE及 E，分別用pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解，配制成1mmoL·L^-1的PQQ、NE、E溶液；按摩爾比為1:1混合PQQ和NE得反應液A，PQQ和E混合得反應液B，PQQ與NE和E一起混合得反應液C；避光，于37℃水浴孵育24h；

PQQ與NE反應后產物PQQNE的質譜圖顯示M=481，482.22為M+1峰，483.36為M+2峰，464.24為M-OH峰；PQQNE分子量481，PQQ的羧基和NE的氨基去掉一份子水得到了酰胺；PQQ與E反應液只檢測到PQQ的分子離子峰，未能檢測到產物的分子離子峰；由于E分子結構上氨基上的氫被甲基取代，阻礙了其反應；

（7）生物樣本處理

（7.1）腦組織樣品處理

腦組織稱重，每1mg腦組織加入7.5μL組織裂解液，勻漿，15000rpm/4℃離心15min，取上清液，再離心15min，得上清液，加入等體積的PCA沉淀劑，4℃冰浴放置10min后，再離心15min，所得腦組織液a備用；

組織裂解液為：1.2M K₂HPO₄+2M EDTA-2Na；

PCA沉淀劑為：0.1M高氯酸；

（7.2）固相萃取提取腦組織樣品

SPE萃取小柱Generik PCX用1 mL甲醇活化，1mL去離子水平衡，將腦組織液a上樣，用2mL去離子水，2mL甲醇沖洗，抽干，用1mL體積比4/96的甲酸/甲醇洗脫，N₂吹干，所得殘渣用0.1%甲酸水溶液溶解后進行毛細管電泳分析及UPLC-MS分析；

（8）標準曲線制備

準確吸取NE、E儲備液，用空白腦組織液a分別配成NE濃度為0.02、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μmoL·L^-1系列含藥腦組織液；E濃度為0.1、0.5、2.5、12.5、62.5、312.5μmoL·L^-1系列含藥腦組織液，與空白腦組織液a分別以（7.2）方法處理后進樣分析，所得NE、E峰面積扣除相應的空白腦組織液a峰面積為縱坐標Y，NE、E的濃度X為橫坐標，進行回歸分析，得NE的回歸方程為Y= 6250315X + 4672.8，R² = 0.9998，線性范圍0.02~62.5μmoL·L^-1；得E 的回歸方程為Y= 862932X + 2036.2，R² = 0.9996，線性范圍0.1~312.5μmoL·L^-1；NE檢出限為0.1nmoL·L^-1，E檢出限為 0.2 nmoL·L^-1，S／N=3；遷移時間和峰面積的相對標準偏差RSD分別小于0.68％及1.06％；

（9）回收率及精密度測定

（9.1）提取回收率測定

取經處理后的空白腦組織液a，精確配制同時含NE和E，濃度分別為0.5、5.0、50μmoL·L^-1的含藥腦組織液各5份，按（7.2）方法處理后進行毛細管電泳分析，

含藥腦組織液經過固相萃取所得的峰面積與相應濃度未經固相萃取提取的標準液直接進樣所得的峰面積比值計算得到提取回收率；

（9.2）方法回收率：精確配制同時含NE和E，濃度分別為0.5、5.0、50μmoL·L^-1的含藥腦組織液各5份，按上述（7.2）方法處理后分析，用標準曲線計算出NE及 E的濃度，與理論濃度比值計算得到方法回收率；

（9.3）精密度試驗

精確配制同時含NE和E，高、中、低3種濃度分別為0.5、5.0、50μmoL·L^-1的含藥腦組織液各5份，按上述（7.2）方法處理后在確定的色譜條件下于同一天內連續進樣5次，根據峰面積計算精確度。