[發(fā)明專利]一種基于腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的3D共培養(yǎng)模型

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610985876.5
• 申請日: 2016-11-09
• 公開（公告）號: CN108060132A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黨永軍;楊宸;李增霞;倪曉凌;崔照盟;高強(qiáng);王嘉琦
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的3D共培養(yǎng)模型。本發(fā)明將腫瘤細(xì)胞使用綠色熒光蛋白標(biāo)記，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞使用紅色熒光蛋白標(biāo)記，將兩種細(xì)胞通過使用制備的甲基纖維素凝膠培養(yǎng)基構(gòu)建3D共培養(yǎng)模型。本發(fā)明制備的3D模型模擬了體內(nèi)腫瘤的缺氧環(huán)境，并通過將腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建了體內(nèi)腫瘤微環(huán)境內(nèi)兩種細(xì)胞之間相互促進(jìn)的效果本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞構(gòu)成的3D共培養(yǎng)模型不僅模擬了體內(nèi)腫瘤缺氧的環(huán)境，提供了與體內(nèi)腫瘤微環(huán)境類似效果，具有基礎(chǔ)研究以及臨床藥物應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新型3D共培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法，具體涉及一種基于腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的3D共培養(yǎng)模型，該3D共培養(yǎng)模型可用于基礎(chǔ)研究以及建立體外藥物篩選模型。

背景技術(shù)

據(jù)報(bào)道，逐步增加的癌癥發(fā)病率和死亡率，已經(jīng)成為了導(dǎo)致中國人死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅中國人的健康。近年來，隨著手術(shù)技術(shù)的逐步進(jìn)步以及規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化的放化療的應(yīng)用，癌癥的臨床治療水平已經(jīng)有了較大的進(jìn)步，但是例如胰腺癌，非小細(xì)胞型肺癌等癌癥的五年生存率并沒有得到有效的提高。其原因主要是因?yàn)榕R床化療藥物的療效非常有限。許多臨床藥物在基礎(chǔ)研究階段均顯現(xiàn)出具有強(qiáng)大的體外抑制腫瘤細(xì)胞的效果，但是進(jìn)入臨床在作用于病人體內(nèi)腫瘤時無法發(fā)揮出類似的療效。例如臨床治療晚期胰腺癌的一線藥物吉西他濱，在常規(guī)二維細(xì)胞培養(yǎng)時對胰腺癌細(xì)胞系Capan-1，BxPC-3，Panc-1等的IC50均在100nM以下，但是當(dāng)應(yīng)用于晚期胰腺癌病人顯現(xiàn)出只能部分延緩腫瘤的進(jìn)展，其中大部分患者只有6個月的中位生存期。類似的情況在腫瘤新藥的研發(fā)中并不少見，增加了腫瘤患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及生存質(zhì)量的降低。

研究實(shí)踐顯示，造成藥物在基礎(chǔ)研究和臨床患者效果不一致的原因較多，其中最重要的一點(diǎn)就是現(xiàn)有的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，即2D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境不一致。究其原因，體內(nèi)腫瘤由于增殖迅速，新生血管供血供氧跟不上腫瘤的增殖從而會導(dǎo)致腫瘤部分區(qū)域缺氧，繼而壞死；同時，體內(nèi)腫瘤是一個立體的結(jié)構(gòu)，腫瘤的氧氣，營養(yǎng)物質(zhì)離血管越近供應(yīng)越充足，越遠(yuǎn)離血管的腫瘤組織則會出現(xiàn)相應(yīng)的缺氧壞死，而藥物在腫瘤組織內(nèi)的分布梯度也與距離血管的距離有關(guān)。目前的研究中的藥物篩選模型大部分使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，這種方法使細(xì)胞貼壁于組織處理過的培養(yǎng)皿的表面，成為單層貼壁生長，但是由于其不存在體內(nèi)腫瘤的氧氣，營養(yǎng)的梯度從而難以模擬腫瘤的微環(huán)境。在2D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，藥物直接作用于所有的貼壁細(xì)胞，不符合體內(nèi)腫瘤作為一個立體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。

藥物篩選獲得的藥物和臨床腫瘤患者的療效不一致還有一個重要原因，那就是以往的藥物設(shè)計(jì)思路大部分均為抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但是真實(shí)的腫瘤微環(huán)境內(nèi)不只有腫瘤細(xì)胞。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)是腫瘤微環(huán)境內(nèi)最重要的非癌組分，近年其和腫瘤細(xì)胞的密切關(guān)系獲得研究者們越來越多的關(guān)注。腫瘤細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的活化，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可以分泌TGF-β，IL-6，F(xiàn)GF-2等生長因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，增殖，遷移，同時腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可以發(fā)揮屏障的作用使化療藥物的作用降低。兩種細(xì)胞的這種相互促進(jìn)作用使得腫瘤細(xì)胞難以被化療藥物清除。

3D細(xì)胞培養(yǎng)模型是一種體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞使其成為類似于體內(nèi)的立體結(jié)構(gòu)的一種新型培養(yǎng)模型，逐步受到研究者的重視。3D培養(yǎng)常規(guī)2D培養(yǎng)的優(yōu)勢主要在于以下幾點(diǎn)：首先，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型可以形成立體的結(jié)構(gòu)，模擬體內(nèi)腫瘤的立體結(jié)構(gòu)，同時模擬前文所述的腫瘤內(nèi)氧氣，營養(yǎng)物質(zhì)的梯度以及缺氧環(huán)境；其次，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型不會有常規(guī)2D細(xì)胞培養(yǎng)中存在的細(xì)胞接觸抑制效應(yīng)，從而更加符合體內(nèi)腫瘤的生長模型；最后，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型內(nèi)的腫瘤細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞團(tuán)內(nèi)可以自由交流，從而模擬體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境。由于3D細(xì)胞培養(yǎng)模型的種種優(yōu)勢，目前已經(jīng)開發(fā)出了許多不同類型的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，如懸滴法(hanging drop)、瓊脂-液體覆蓋法(soft agar-liquid overlay)、3D多孔支架(porous 3-D scaffold)等。3D細(xì)胞培養(yǎng)模型也被越來越多地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，高通量藥物篩選等。