[發明專利]小分子化合物組合及利用該小分子化合物組合誘導分化的細胞制備成骨細胞的方法

有效

• 申請號: 201610975762.2
• 申請日: 2016-11-07
• 公開（公告）號: CN108060121B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 胡敏;李燕皎;王兆杰
• 申請（專利權）人: 惠州市正多實業有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/071
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

本發明公開了一種小分子化合物組合及利用該小分子化合物組合誘導分化的細胞制備成骨細胞的方法。所述小分子化合物組合包括按時序分階段使用的第一階段小分子化合物和第二階段小分子化合物，所述第一階段小分子化合物包括TGF?β受體抑制劑，WNT/β?catenin激動劑和cAMP激動劑；所述第二階段小分子化合物包括賴氨酸脫乙酰基酶抑制劑，TGF?β受體抑制劑，PKC抑制劑，WNT/β?catenin激動劑和cAMP激動劑。本發明通過小分子化合物分階段誘導，能夠將分化的細胞轉分化為成骨細胞，各步驟可實現精準質控，便于標準化操作和規模化生產。本發明提供的方法供體來源廣泛，患者本人即可作為供體，可在較短時間內獲得基礎研究、臨床治療或組織工程生產所需的成骨細胞。

技術領域

本發明涉及細胞生物學，組織工程和再生醫學領域，尤其涉及一種小分子化合物組合及利用該小分子化合物組合誘導分化的細胞制備成骨細胞的方法。

背景技術：

現有的骨組織工程或再生醫學成骨種子細胞包括分化晚期的成骨細胞、成骨細胞株、骨髓混合細胞或純化的間充質干細胞。但此類細胞的存在來源有限、獲取過程復雜并伴隨供體較重的傷害等問題，因而應用受限。

多種分化的細胞如皮膚成纖維細胞具有來源豐富、易于獲取并易于在體外長期大量擴增培養的優點。目前利用細胞轉分化技術已經可以把分化的細胞如皮膚成纖維細胞直接誘導為成肌細胞、神經元、肝細胞、成骨細胞等多種不同類型的功能細胞；或先誘導為多能干細胞后，再進一步定向誘導為相應的功能細胞。上述采用細胞轉分化技術從某種特定分化的細胞如皮膚成纖維細胞直接或間接誘導獲得的功能細胞已經不再保持源細胞的分子特征與功能，但獲得了相應目標細胞的典型分子特征與細胞功能。目前，上述誘導性功能細胞已逐漸應用于疾病模型研究、臨床治療研究與組織工程研究。

傳統的細胞轉分化需要通過導入特定的外源性基因實現，有時還需要相應的小分子化合物、細胞因子或重組蛋白協同作用。文獻已有較多采用特定外源性基因把某一分化的細胞誘導為另一功能性分化的細胞的報道。如文獻已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3單獨或協同作用使皮膚成纖維細胞轉分化為在體外、體內都具有骨形成作用的成骨細胞的報道。但導入外源性基因存在致瘤風險，并可能使目標細胞產生免疫原性，難以推廣應用。2013年，鄧宏魁報道僅采用小分子化合物或其組合可以實現鼠皮膚成纖維細胞重編程為神經細胞的轉分化過程，并證實該細胞轉分化技術具有誘導過程短、誘導系統穩定、易于質控、成本低、無外源性基因插入導致的致瘤風險、獲得的目標細胞具有良好的安全性與穩定性且無免疫原性，具有潛在的臨床應用價值與產業化前景。此后，申請號為201410075246.5的中國專利申請提供了一種把分化的細胞誘導轉分化為神經干細胞的方法及其應用。具體地，該申請涉及采用組蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制劑、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制劑和轉化生長因子β(TGF-β)信號通路抑制劑的組合，在正常生理低氧環境下誘導成纖維細胞、上皮細胞等分化的細胞轉分化為具有良好多能性及傳代穩定性的神經干細胞。申請號為201610213644.8的中國專利申請提供了一種誘導成纖維細胞轉分化為心肌細胞的誘導培養基、方法及其應用，所述誘導培養基包含基礎培養基和誘導小分子組合，所述誘導小分子組合為6TCFOW或SCFOV，其中6為E61541、T為苯環丙胺、C為CHIR99021、F為毛喉素、O為Dorsomorphin、W為IWR-1、S為SB431542、V為丙戊酸。該申請誘導培養基能夠將成纖維細胞誘導轉分化為心肌細胞。目前，通過采用單純小分子化合物或其組合誘導人類分化的細胞如皮膚成纖維細胞獲得施旺細胞(THOMA EC，et al，2014)、神經細胞(HU W，et al，2015)、胰島細胞(Sh eng Ding，et al，2015)的成果已陸續見諸報道。

由于人類與小鼠存在約25％的基因差異，而將上述在小鼠細胞實驗中獲得成功的專利申請技術方案應用于人的同類細胞轉分化可行性不高；另一方面，由于誘導同類細胞轉分化獲得不同目標細胞的具體理論基礎與技術手段并不相同，申請人采用上述報道的技術方案分別重復試驗，既未能把應用于小鼠細胞的轉分化技術方案成功應用于人的同類細胞轉分化，也未能把人類分化的細胞誘導轉分化為成骨細胞。

發明內容