[發明專利]一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法

有效

• 申請號: 201610973505.5
• 申請日: 2016-11-04
• 公開（公告）號: CN106636168B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 應漢杰;許佳慧;柳東;王巖巖;沈曉寧;劉俊
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12P7/26;C12P7/16;C12P1/04;C12P19/04;C12R1/145
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法，其特征在于，該方法是利用二型內含子基因敲除技術在丙酮丁醇梭菌的Spo0A基因中插入內含子序列。本發明提供了一種簡單、高效的調控EPS合成的方法，借助此方法得到的重組菌株對EPS具有較高的調控作用，當以葡萄糖為碳源，在100ml厭氧瓶中利用載玻片生物膜培養法培養丙丁菌生物膜時，生物膜厚度為5.81μm，而同等條件培養的出發菌株生物膜厚度達到24.6μm。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法。

背景技術

生物被膜又稱生物膜(biofilm)是在生物或非生物介質表面由微生物及其胞外基質(Extracellular polymeric substance,EPS)形成的致密、復雜的生物聚集體。EPS作為生物膜的主要組成物質，對保持生物膜的結構和功能的完整性、代謝物質傳質通道順暢具有重要作用。EPS是細胞在固體介質誘導下自主合成的富含大分子多糖的胞外結構，具有良好的持水性、溶脹性、透過性，能夠穩定細胞表面的水化層、及時泵出細胞的反應物、為細胞創造有益的微環境，可認為是生物相容性最佳的固定介質。同時，EPS為細胞隔離外界毒性物質提供了一道天然屏障，因而提高了EPS中微生物細胞的抗逆能力。因此，細胞在EPS中能夠大量增殖形成密集的菌群進而展示集群效應。集群效應可使群體成員實現生理協同作用，借助個體間的互相刺激而使個體的行為、生理、形態發生變化，使多個生物個體在行為上相互協作，從而提高整個種群的代謝及適存能力。

在臨床醫學領域，超過80％的慢性感染疾病都與體內細菌形成EPS有關，而細菌形成EPS后對抗生素等殺菌劑和宿主免疫系統的敏感性顯著降低，因此，大部分有關EPS機理的研究都集中在如何清除人體器官及外源性生物植入材料表面上的EPS。然而，作為EPS的另一種存在形式——固定化發酵過程中細胞形成的EPS卻至今鮮有研究，尤其是固定化細胞形成EPS后表現出的較高底物耐受性和較快的發酵效率的機制機理到現在還不是很清楚。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法。

本發明還要解決的技術問題是提供利用調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)合成的方法構建得到的丙酮丁醇基因工程菌。

本發明最后要解決的技術問題是提供利用上述基因工程菌在EPS催化體系中的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種調控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法，該方法是利用二型內含子基因敲除技術在丙酮丁醇梭菌的Spo0A基因中插入內含子序列。在Spo0A基因中插入內含子序列，最終使Spo0A基因不能正常表達，從而引起丙酮丁醇梭菌胞外聚合物(EPS)的合成。

其中，所述的丙酮丁醇梭菌保藏編號為CGMCC No.5234，該菌株的具體信息在申請號為201210075094.X的中國專利中詳細公開。

其中，所述的Spo0A基因為CA_C2071，其核苷酸序列如SEQ ID No.：1所示。Spo0A基因編碼一種孢子生成蛋白，在發育早期通過多組分磷酸化途徑而被激活，是雙組份應答性調節蛋白大家族的成員之一，調控并起始孢子形成作用所需基因的轉錄。

其中，利用二型內含子基因敲除技術將SEQ ID No.：2所示的內含子序列插入Spo0A基因的第242bp和第243bp之間

其中，所述二型內含子基因敲除技術的操作方法如下：

(1)分析SEQ ID No：1所示的序列，得到內含子的核苷酸序列和基因的插入位點；

(2)內含子序列構建到二型內含子基因敲除質粒中，得到重組質粒；