[發(fā)明專利]重組牛胰蛋白酶突變體及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610973326.1
• 申請日: 2016-11-04
• 公開（公告）號: CN108018277A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發(fā)明（設計）人: 文良柱;趙珊珊;胡婷
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;上海復星醫(yī)藥（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

本發(fā)明涉及生物技術領域，提供了一種重組牛胰蛋白酶突變體的制備方法以及所用的重組牛胰蛋白酶突變體。本發(fā)明是在大腸桿菌系統(tǒng)中表達重組牛胰蛋白酶突變體，表達量高，進一步提供了冷誘導表達載體和無需經(jīng)過變性和復性的可溶性表達方法，并且純化步驟簡單方便；本發(fā)明的特點是重組牛胰蛋白酶突變體活性高、特異性強，且制備工藝簡單、成本低。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種重組牛胰蛋白酶突變體及其制備方法。

背景技術

胰蛋白酶( Trypsin，EC 3. 4. 21. 4) 是一種以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，擁有絲氨酸蛋白酶的一些典型特征：具有高度催化活性的三聯(lián)體氨基酸( His-40，Asp-84，Ser-177)；穩(wěn)定催化中間產(chǎn)物的氧離子孔 ( Gly-175，Ser-177＆Ser-192)； 底 物 特異 性 結(jié) 合 口 袋( Asp-171、Gly-194＆Gly-204)； 12 個 半 胱 氨 酸 殘 基 構(gòu) 成的 6 對 二硫鍵。在胰臟中，其以胰蛋白酶原的前體形式被合成和分泌。胰蛋白酶原在腸激酶或有活性的胰蛋白酶的催化下分解成為有活性的胰蛋白酶。不同物種的胰蛋白酶分子大小有一定差異，牛胰蛋白酶有223個氨基酸殘基組成，分子量為23.3kDa，等電點為10.1-10.5.

胰蛋白酶水解多肽鏈中賴氨酸和精氨酸羧基端形成的肽鍵，在基因工程胰島素的生產(chǎn)過程中，胰蛋白酶能將胰島素原轉(zhuǎn)化為有活性的胰島素。但是由于胰蛋白酶對底物( Arg、Lys) 的切割選擇性不強，在胰島素的生產(chǎn)中就會產(chǎn)生副產(chǎn)物。而提高胰蛋白酶對 Arg 的切割選擇性，降低對 Lys的切割選擇性可以減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。Sichler 等分析人胰蛋白酶特異性結(jié)合口袋時發(fā)現(xiàn)：位于口袋底部的 Asp171可與 Arg 的側(cè)鏈胍基形成強的離子鍵，與側(cè)鏈較短的 Lys 只能以水橋的形式相互作用；口袋中的 Ser172 能夠與 Arg 或Lys 形成氫鍵，加固底物與特異性結(jié)合口袋的結(jié)合。由于水橋作用力弱，Lys 與Asp171 的結(jié)合不牢固，Ser172 與 Lys 形成的氫鍵對于酶與底物 Lys 殘基的穩(wěn)定性結(jié)合起至關重要的作用。改變Ser172為其他氨基酸，或許可以降低對 Lys的切割選擇性。

目前制備胰蛋白酶的方法主要有兩類：一是從豬、牛等的胰臟中提取，因其方法相對簡單，被廣泛采用，但是該方法因不能完全除去其他蛋白質(zhì)酶，且產(chǎn)品中的動物源病毒如口蹄疫病毒、瘋牛病病毒等不能完全除去，因此其應用存在一定的局限性及風險性；另一種是采用基因重組的方法制備。目前基因重組的方法大多數(shù)是在大腸桿菌中通過基因重組的方法制備人源、豬或牛源胰蛋白酶，該方法先經(jīng)表達得到不具活性的胰蛋白酶原包涵體，然后使胰蛋白酶原包涵體經(jīng)過變性、復性過程，再經(jīng)過酶切切去酶原的前體部分才能得到有活性的酶。而在所述變性、復性過程中，復性率不可能達到100%，因此該方法費時費力，產(chǎn)率不高。專利201410440706.X公開了一種應用畢赤酵母分泌表達牛胰蛋白酶的方法，該方法避免了形成包涵體，省去變性和復性過程，可直接從培養(yǎng)基中獲得酶原，通過腸激酶酶切，再經(jīng)純化等步驟得到了高活力的牛胰蛋白酶，但由于牛胰蛋白酶原分子量較大，分泌量有限，故最終獲得酶含量較低。專利201310043541.8公開了一種應用大腸桿菌可溶性表達牛胰蛋白酶的方法，該方法避免了形成包涵體，解決了因分子量大而難分泌表達的難題，但是該可溶性表達的牛胰蛋白酶因?qū)Υ竽c桿菌毒性較大而表達量較低。

本領域需要提供一種牛胰蛋白酶突變體來加強對Arg 的切割選擇性，降低對 Lys的切割選擇性，同時需要一種提高牛胰蛋白酶突變體活性和含量的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種重組牛胰蛋白酶突變體以及制備重組牛胰蛋白酶突變體的方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種在大腸桿菌中可溶性表達牛胰蛋白酶突變體的方法，將該方法制備得到的包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體直接酶切去除融合蛋白GST后即可得到有活性的牛胰蛋白酶突變體，并且后續(xù)的純化步驟也簡單方便。