[發(fā)明專利]重組牛胰蛋白酶突變體及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610973326.1
• 申請日: 2016-11-04
• 公開（公告）號: CN108018277A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 文良柱;趙珊珊;胡婷
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進(jìn)

1.一種包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體，其特征在于：包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體序列結(jié)構(gòu)從N端到C端依次包括A1-A2-A3-A4， 氨基酸序列為Seq IDNo.12，其中A1為融合蛋白GST，A2為A1和A3之間的柔性連接蛋白GSGS，A3為腸激酶識別位點(diǎn)DDDDK，A4為重組牛胰蛋白酶突變體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體，其特征在于：其中A1氨基酸序列為Seq ID No.1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體，其特征在于：其中A2核苷酸序列為Seq ID No.2。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體，其特征在于：其中A3核苷酸序列為Seq ID No.3。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體，其特征在于：其中A4氨基酸序列為Seq ID No.5。

6.一種冷誘導(dǎo)表達(dá)載體pCOLDI，包含權(quán)利要求1所述的包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于：包括包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體，基因序列為Seq ID No.11，插入質(zhì)粒pCOLDI的SacI/HindIII酶切位點(diǎn)。

8.一種包含重組牛胰蛋白酶突變體的工程菌，其特征在于：其包含權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體。

9.一種包含重組牛胰蛋白酶突變體的工程菌，其特征在于：由將權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)而獲得。

10.一種重組牛胰蛋白酶突變體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)培養(yǎng)權(quán)利要求8或9任一所述的包含重組牛胰蛋白酶突變體的工程菌并誘導(dǎo)重組牛胰蛋白酶突變體基因的表達(dá)；

(2)收集菌體；

(3)破碎菌體；

(4)收集上清；

(5)純化上清中的包含融合蛋白GST的重組牛胰蛋白酶突變體；

(6)重組牛胰蛋白酶突變體的活化；

(7)重組牛胰蛋白酶突變體的純化。

11.根據(jù)權(quán)利要求10的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)培養(yǎng)包含重組牛胰蛋白酶突變體基因的工程菌并誘導(dǎo)重組牛胰蛋白酶突變體基因表達(dá)，具體為：接種重組工程菌陽性克隆100ul到20ml的LB培養(yǎng)基中，于30-37℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過夜，按4%接種量接過夜菌于500ml的LB培養(yǎng)基，30-37℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對數(shù)期，接種到裝有6L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，初始參數(shù)為：發(fā)酵溫度30-37℃，攪拌速度200-300rpm，通氣量15L/min，pH為6.5-7.5，控制攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量以維持溶氧始終在30%以上，培養(yǎng)基配方如下：發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補(bǔ)料培養(yǎng)基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過程中pH調(diào)控；當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，溶氧迅速上升時開始補(bǔ)料，控制補(bǔ)料速度、轉(zhuǎn)速、通氣保證控制溶氧在30%以上；補(bǔ)料5hr-8hr后，降溫至10-15℃，調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5，加入終濃度0.1-1mmol/L的IPTG進(jìn)行有氧誘導(dǎo)，溶氧不低于20%，繼續(xù)培養(yǎng)10-24h后出罐，收集菌體。