[發(fā)明專利]一種測量刀鱭GnRH-R含量的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610971122.4
• 申請日: 2016-11-04
• 公開（公告）號(hào): CN106568979B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方弟安;張敏瑩;徐東坡;劉凱;周彥鋒;段金榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
• 主分類號(hào): G01N33/74
• 分類號(hào): G01N33/74;G01N33/532
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

本發(fā)明公開了一種測量刀鱭GnRH?R含量的方法及其應(yīng)用，包含以下步驟：(1)繪制GnRH?R標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是492nm條件下的絕對吸光度值與GnRH?R濃度的關(guān)系曲線；(2)通過ELISA方法檢測待測樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GnRH?R的含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明所述測量刀鱭GnRH?R含量的方法快速、準(zhǔn)確，且靈敏度高；(2)所述方法檢測過程中克服了以往采用同位素標(biāo)記的手段，因而減少了放射性污染；(3)所述方法為探明魚類等低等脊椎動(dòng)物生殖周期調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)；(4)所述方法具有高特異性，能夠檢測痕跡量的GnRH?R酶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種酶的檢測方法，尤其涉及一種測量刀鱭GnRH-R含量的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是下丘腦-垂體-性腺軸(Hypohthalamus-Pituitary-Gonadal axis，HPG)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子，也是調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)功能的關(guān)鍵信號(hào)分子，能調(diào)節(jié)垂體及卵巢水平的卵泡刺激素(folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizinghormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E₂)、孕激素(Progestogen，P4)等多種性激素水平。GnRH通常由下丘腦的神經(jīng)細(xì)胞合成并分泌，通過垂體門脈系統(tǒng)以脈沖的方式分泌到垂體前葉，與其促性腺細(xì)胞表面的GnRH受體(GnRH Receptor，GnRH-R)結(jié)合，促進(jìn)性腺激素即FSH和LH的合成與分泌，從而維持正常的生殖系統(tǒng)功能。GnRH-R是GnRH發(fā)揮生物活性的必需物質(zhì)。大量研究表明，GnRH存在三種亞型(GnRH1，GnRH2，GnRH3)，其功能既有交叉也有各自特異的作用。大多數(shù)高等動(dòng)物機(jī)體內(nèi)GnRH-R有兩種類型GnRH-R I和GnRH-R II。研究發(fā)現(xiàn)GnRH-R不僅位于HPG系統(tǒng)，在動(dòng)物機(jī)體的其他組織也有分布，尤其是在外周性腺組織中。檢測生物機(jī)體體液內(nèi)GnRH-R的含量變化是研究其生殖規(guī)律的基礎(chǔ)條件。

研究發(fā)現(xiàn)GnRH-R是一種大約由327-328個(gè)氨基酸構(gòu)成的，相對分子量約為38kDa的糖蛋白，結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其含7個(gè)跨膜區(qū)，是典型的G蛋白(protein G)偶聯(lián)受體。當(dāng)GnRH與細(xì)胞膜上的GnRH-R結(jié)合后，GnRH將激活其受體以刺激垂體前葉的多種信號(hào)通路。在GnRH或其它內(nèi)源因素的刺激下，GnRH和GnRH-R結(jié)合，激活磷脂酶C(PLC)，促使多聚磷酸肌醇的分解，形成IP3和DG，IP3誘導(dǎo)Ca²⁺從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放。GnRH與受體結(jié)合的同時(shí)也激活了Ca²⁺通道，促使細(xì)胞外Ca²⁺進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Ca²⁺和DG激活蛋白激酶C，接著細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺和蛋白激酶C(PKC)相互作用進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的調(diào)控，從而誘導(dǎo)促性腺激素的釋放。RNA印跡、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、原位雜交和受體結(jié)合分析表明，在大鼠等哺乳動(dòng)物垂體細(xì)胞中，GnRH-R大量分布在表達(dá)LH或FSH的促性腺細(xì)胞上。除下丘腦-垂體軸系以外，GnRH-R在卵泡顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、正常子宮組織、乳腺組織和前列腺均有GnRH-R的表達(dá)。

研究表明，GnRH-R的表達(dá)和合成由多種內(nèi)源性激素如GnRH，E₂，P₄和抑制素等的調(diào)控，而這些激素通常共同存在于血液循環(huán)中，而激素之間的相互作用也會(huì)影響到GnRH-R的表達(dá)和合成。大量研究表明GnRH-R水平在高等脊椎動(dòng)物生殖周期中呈動(dòng)態(tài)變化，這種動(dòng)態(tài)變化模式與垂體上結(jié)合的GnRH數(shù)量和從卵巢濾泡分泌的E₂產(chǎn)量密切相關(guān)，這些結(jié)果反映了雌二醇、孕酮、抑制素等內(nèi)分泌激素對GnRH-R相互作用的綜合效應(yīng)。而在魚類等低等脊椎動(dòng)物生殖周期的調(diào)控中，GnRH-R是否具有類似的調(diào)控機(jī)制一直是一個(gè)懸而未決的科學(xué)問題。