[發明專利]一種測量刀鱭GnRH-R含量的方法及其應用

有效

• 申請號: 201610971122.4
• 申請日: 2016-11-04
• 公開（公告）號: CN106568979B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 方弟安;張敏瑩;徐東坡;劉凱;周彥鋒;段金榮
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/532
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

1.一種測量刀鱭GnRH-R含量的方法，其特征在于，包含以下步驟：

（1）繪制GnRH-R標準品標準曲線，所述標準曲線是492nm條件下的絕對吸光度值與GnRH-R濃度的關系曲線；

（2）通過ELISA方法檢測待測樣品的吸光度值，根據標準曲線計算GnRH-R的含量；

所述標準曲線中GnRH-R標準品的濃度范圍為0～32 mIU/mL，絕對吸光度值范圍為0～1.3907；

所述待測樣品為從刀鱭的血液中分離純化獲得的GnRH-R蛋白；

所述ELISA方法的具體步驟為：

（1）抗體包被：利用DE-52液相色譜層析柱從家兔血清中層析獲得anti-GnRH-R蛋白，轉移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中，加入 PBS緩沖液，水浴包被和孵育；

（2）封閉：三步洗滌：PBS-T緩沖液連續洗滌、等體積的PBS緩沖液洗滌、PBS-1% BSA緩沖液洗滌后， 37℃培養4小時或在4℃過夜培養；

（3）樣品孵育：PBS-T洗滌、PBS洗滌后，在96孔板中加入樣品，連續用PBS-BSA稀釋，將稀釋液加到酶標板中，37℃孵育4小時；

（4）生物素標記的anti-GnRH-R孵育：用緩沖液對步驟（3）孵育后的樣品進行1:400的稀釋，緩沖液為含有0.1% BSA，0.1% Tween緩沖液和0.002%硫柳汞的混合溶液，pH值調整為7.0，稀釋完成后加入生物素標記的抗體，37℃孵育3-4小時；

（5）鏈霉親和素-辣根過氧化物酶共軛培養：按照步驟（3）所述洗滌方法再次洗滌滴定板，向各孔中加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶，37℃孵育4-6小時；

（6）酶法顯色反應：按照步驟（3）所述方法洗滌步驟（5）孵育后的滴定板，室溫黑暗環境中染色，測定492nm處的吸光度值；

其中，步驟（5）中加入的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶是經PB-BSA-T按1:2000稀釋后的產物；步驟（6）中酶法顯色反應的具體步驟為：在每孔中加入鄰苯二胺，具體為含有0.02％過氧化氫的3 mg/mL 0.1M的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，pH值為5.0；并通過HCl終止反應。

2.權利要求1所述的測量刀鱭GnRH-R含量的方法在刀鱭人工繁育中的應用。

3.權利要求1所述的測量刀鱭GnRH-R含量的方法在測定刀鱭的生殖內分泌激素中的應用。