[發明專利]一種pH不敏感熒光蛋白標記的生物組織的熒光控制方法

有效

• 申請號: 201610967343.4
• 申請日: 2016-10-31
• 公開（公告）號: CN106525791B
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 劉秀麗;周宏福;劉靈;呂曉華;曾紹群
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 許恒恒

本發明公開了一種紅色熒光蛋白DsRed標記生物組織的熒光控制方法，采用含有過渡金屬離子的淬滅化學試劑將紅色熒光蛋白標記的生物組織熒光蛋白淬滅，得到熒光淬滅的生物組織；采用含有金屬離子螯合劑的重激活化學試劑將熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，本發明利用過渡態金屬離子和氫離子的協同作用將紅色熒光蛋白標記的生物組織熒光蛋白淬滅，利用金屬離子螯合劑和氫氧根離子的協同作用將熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，實現DsRed標記的生物組織的熒光的精確控制，淬滅徹底完全，激活方便，效果好，對比度高；該方法可以應用于生物組織的層析成像，熒光淬滅完全，成像時不存在背景熒光干擾的問題。

技術領域

本發明屬于生物成像領域，更具體地，涉及一種pH不敏感熒光蛋白標記的生物組織的熒光控制方法。

背景技術

在生物組織中詳細地獲取分子和蛋白的空間分布，可以更加清楚地了解生物學信號的傳導通路，解析生物功能的形成，是理解生物體結構和功能關系的重要基礎。熒光蛋白標記技術作為一種有用的基因標記手段，能夠在活體狀態下，針對感興趣的細胞和亞細胞結構進行標記，同時，為了更好的研究這些細胞和亞細胞結構的相互關系，在同一生物體內進行多種熒光蛋白共標記的方法，已被廣泛應用于生物學及醫學領域。

針對厚組織進行光學成像時，目前已有的層析技術主要有兩種：一種是光學層析技術，通過光學方法抑制焦面以外的熒光從而提高z向分辨率。光學層析技術的主要限制在于其z向分辨率只能夠達到500nm，并且較低的z向分辨率極大地限制了多色熒光蛋白標記的生物組織亞細胞結構成像的需求；另一種是物理層析技術，通過將生物組織包埋在樹脂中，通過物理切片的方式產生組織薄片，再對組織薄片進行寬場成像，物理層析技術的主要限制在于通過這種方法進行成像的過程中，組織薄片容易丟失，操做復雜，得到的圖像，其后期處理及三維配準非常困難，無法用于大體積的生物組織。

pH不敏感的熒光蛋白，如紅色熒光蛋白DsRed用于標記生物組織時，由于沒有合適的熒光控制方法，成像時只能采用物理層析進行大體積成像，例如采用雙光子顯微鏡進行點掃描，成像速度很慢，而且存在背景熒光干擾、軸向分辨率低的問題。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種紅色熒光蛋白DsRed標記的生物組織的熒光控制方法，其目的在于利用過渡金屬離子和氫離子的協同作用將紅色熒光蛋白標記的生物組織熒光蛋白淬滅，利用金屬離子螯合劑和氫氧根離子的協同作用將熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，實現DsRed標記的生物組織的熒光控制，由此解決現有技術的pH不敏感的熒光蛋白標記生物組織由于熒光不能控制或缺乏合適的熒光控制方法而導致的進行熒光成像時的背景熒光干擾、軸向分辨率低、成像速度慢的技術問題。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種紅色熒光蛋白DsRed標記生物組織的熒光控制方法，包括如下步驟：

(1)熒光淬滅：采用淬滅化學試劑將紅色熒光蛋白DsRed標記的生物組織的熒光淬滅，得到熒光淬滅的生物組織，所述淬滅化學試劑包括過渡態金屬離子，所述淬滅化學試劑的pH為3～6；

(2)熒光重激活：采用重激活化學試劑將步驟(1)所述的熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，所述重激活化學試劑包括金屬離子螯合劑，所述重激活化學試劑的pH為10～13。

優選地，所述淬滅化學試劑的pH為3～5。

優選地，所述淬滅化學試劑為過渡態金屬離子化合物的水溶液。

優選地，所述淬滅化學試劑為過渡態金屬離子化合物的水溶液和酸的混合溶液。

優選地，所述酸為醋酸。