[發明專利]一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法

有效

• 申請號: 201610966616.3
• 申請日: 2016-10-28
• 公開（公告）號: CN106613960B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 曾宋君;何倍倍;吳坤林;鄭楓;張建霞;張新華;馬國華;段俊
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發明公開了一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法。本發明在對剛冒出分蘗芽的海倫兜蘭進行一系列藥劑處理及培養獲得莖節拉長的分蘗芽，以分蘗芽的莖節為外植體，采用獨特的培養基進行愈傷組織的誘導和增殖、類原球莖的誘導和增殖、類原球莖的分化和生根壯苗培養獲得優質種苗的愈傷組織再生體系快速繁殖方法，能生產出大量的種苗供應市場并應用于遷地保護和自然回歸，有利于海倫兜蘭的資源保護和可持續利用。

技術領域：

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法。

背景技術：

海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)又稱巧花兜蘭，分布于我國廣西西部和越南北部，觀賞價值高。由于其生境的破壞和人工的過度采挖，其野生植物數量已極為稀少，被《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)列入附錄I而禁止交易，也被世界自然保護聯盟(IUCN)紅色名錄中列為極危物種(CR)亟待保護，在中國也已被中國國家林業局列為極小種群野生植物需要重點保護。進行海倫兜蘭的資源保護，繁殖足夠多的種苗是關鍵。海倫兜蘭的常規繁殖可采用分株，但繁殖速度慢，繁殖率低。無菌播種和組織培養能進行其快速繁殖，但無菌播種材料受季節性限制。而兜蘭在組織培養時，由于外植體去污難、易褐化及增殖速度慢等原因，其組織培養難度極大。

發明內容：

本發明的目的是提供一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法，從而進行海倫兜蘭的規?；敝场?/p>

本發明的海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、愈傷組織的誘導和增殖：取海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)的分蘗芽，切除葉片后進行消毒處理，將其切成帶一個節的莖段，得到消毒后的外植體，然后將外植體接種到誘導培養基中培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，獲得愈傷組織，然后將愈傷組織轉移到增殖培養基上進行增殖培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，愈傷組織大量增殖；

所述的誘導培養基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH5.8～6.0；

所述的增殖培養基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH 5.8～6.0；

b、類原球莖的誘導和增殖：將愈傷組織轉移到類原球莖的誘導和增殖培養基上培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，獲得類原球莖，然后將類原球莖接種到新的類原球莖的誘導和增殖培養基上進行增殖培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，類原球莖大量增殖；所述的類原球莖的誘導和增殖培養基為：每升含有噻重氮苯基脲0.1～0.5毫克、激動素1.0～5.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH 5.8～6.0；

c、類原球莖的分化：將類原球莖接種到分化培養基上培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，類原球莖分化出不定芽，所述的分化培養基為：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH5.8～6.0；