[發明專利]一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法

有效

• 申請號: 201610966616.3
• 申請日: 2016-10-28
• 公開（公告）號: CN106613960B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 曾宋君;何倍倍;吳坤林;鄭楓;張建霞;張新華;馬國華;段俊
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、愈傷組織的誘導和增殖：取海倫兜蘭(Paphiopedilum helenaeAver.)的分蘗芽，切除葉片后進行消毒處理，將其切成帶一個節的莖段，得到消毒后的外植體，然后將外植體接種到誘導培養基中培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照時間12～16小時/天，獲得愈傷組織，然后將愈傷組織轉移到增殖培養基上進行增殖培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照時間12～16小時/天，愈傷組織大量增殖；所述的分蘗芽為莖節拉長的分蘗芽；

所述的誘導培養基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH 5.8～6.0；

所述的增殖培養基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH 5.8～6.0；

b、類原球莖的誘導和增殖：將愈傷組織轉移到類原球莖的誘導和增殖培養基上培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照時間12～16小時/天，獲得類原球莖，然后將類原球莖接種到新的類原球莖的誘導和增殖培養基上進行增殖培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照時間12～16小時/天，類原球莖大量增殖；所述的類原球莖的誘導和增殖培養基為：每升含有噻重氮苯基脲0.1～0.5毫克、激動素1.0～5.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH 5.8～6.0；

c、類原球莖的分化：將類原球莖接種到分化培養基上培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照時間12～16小時/天，類原球莖分化出不定芽，所述的分化培養基為：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH 5.8～6.0；

d、生根壯苗培養：將不定芽切成單芽后轉到生根壯苗培養基上培養，培養溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照時間12～16小時/天，獲得完整植株，所述的生根壯苗培養基為：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉勻漿50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖15～30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養基，pH 5.8-6.0；

e、試管苗移栽：將完整植株在自然光下煉苗10～15天，然后取出植株洗凈根部的培養基，移栽到植金石、松樹皮和泥炭土按質量比2～3:2～3:1混合的栽培基質中培養獲得海倫兜蘭種苗；

所述的莖節拉長的分蘗芽是通過以下方法獲得的：選擇剛冒出分蘗芽的植株生長勢強的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)為母株，對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的500～800倍稀釋水溶液并用其澆透基質，稍干后放入光照人工氣候箱中進行暗/光交替培養，培養溫度25℃～30℃，濕度75％～90％，光照度2000～3000勒克斯；培養過程中每3天澆一次水，每15天對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的500～700倍稀釋水溶液或72％農用鏈霉素可溶性粉劑的3000～4000倍稀釋水溶液一次，35％尅土菌可濕性粉劑的500～700倍稀釋水溶液和72％農用鏈霉素可溶性粉劑的3000～4000倍稀釋水溶液交替使用，獲得3～4厘米長，具有3～4個節的分蘗芽，得到莖節拉長的分蘗芽。

2.根據權利要求1所述的海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法，其特征在于，所述的暗/光交替培養具體為暗培養14～14.5天后光培養12～24小時，連續交替培養，每個周期15天。

3.根據權利要求1或2所述的海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法，其特征在于，步驟a所述的消毒處理具體為：在超凈工作臺上將切除葉片的分蘗芽用體積分數75％酒精浸泡10～30秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡5～10分鐘，無菌水沖洗4～5次，再用質量分數0.1％升汞溶液消毒5～10分鐘，無菌水沖洗4～5次。