[發明專利]一種乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共交聯酶聚集體的制備方法

有效

• 申請號: 201610949314.5
• 申請日: 2016-10-26
• 公開（公告）號: CN107988201B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 邵雷;陳代杰;胡曉植;鄭昆;張駿梁
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N11/18
• 分類號: C12N11/18;C12P5/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 陳詳;馬思敏

本發明提供了一種乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共交聯酶聚集體的制備方法，具體的本發明通過高密度發酵破壁離心后的上清作為粗酶液，將粗酶液中的乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶經戊二醛交聯制備共交聯酶聚集體，而且通過添加吐溫80將共交聯酶聚集體的酶活回收率提高到82％。

技術領域

本發明涉及一種乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共交聯酶聚集體的制備以及該酶聚集體的穩定性和重復使用率的研究，屬于酶固定化技術領域。

背景技術

2011年8月3日，美國食品藥品監督管理局批準由輝瑞公司生產的克唑替尼用于治療ALK基因重排的NSCLC。2016年3月11日，又被批準用于治療ROS1基因突變的NSCLC，其市場需求不斷增加。在其合成過程中，(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是關鍵的手性中間體。現多通過化學法合成(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，但不容易得到高純度的手性化合物，且合成過程復雜，生物合成可以克服這些弊端。

現有的最新的生物合成技術是通過乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共表達菌株的發酵液，通過乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶與NADP和NADPH的輔酶循環再生體系來催化1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙酮合成手性中間體(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)如參考文獻(劉麗勤,張駿梁,譚俊,等.乙醇脫氫酶與葡萄糖脫氫酶偶聯催化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇[J].工業微生物,2016,46(3):8-12.)。

交聯酶聚集體是一種新型的酶固定化技術，能實現酶的聚集和固定化，便于回收利用，而且不需要載體，制備成本低。因此，為了有效地提高手性化合物的制備效率，降低制備成本，本領域技術人員致力于開發催化1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙酮合成手性中間體(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)酶固定化技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共交聯酶聚集體的制備方法。

本發明的第一方面，提供了一種乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共交聯酶聚集體的制備方法，所述方法中包括步驟：

在表面活性劑存在的條件下，經交聯劑進行乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的共交聯反應。

在另一優選例中，所述表面活性劑選自下組：吐溫80、和吐溫60。

在另一優選例中，所述方法中，進行所述共交聯反應的交聯反應體系內表面活性劑和底物酶(乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶)的質量比為0.1～1.2：0.5～1；優選地質量比為0.2～1：0.5～1；最優選為約0.4～0.8：1。

在另一優選例中，定義所述底物酶為乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶之和。

在另一優選例中，所述交聯反應中使用戊二醛作為交聯劑。

在另一優選例中，所述交聯反應體系內戊二醛和底物酶(乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶)的質量比為0.1～1.2：0.5～1；優選為0.2～1.2：1；最優選為約1：1。

在另一優選例中，交聯反應中表面活性劑：交聯劑：底物酶(乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶)的質量比為0.4-0.8：0.8-1.2：0.8-1.2。

在另一優選例中，所述方法包括步驟：

(1)提供含有乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的混合物；

(2)交聯反應

制備交聯反應體系，所述交聯反應體系中包括：步驟(1)提供的含有乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的混合物、交聯劑和表面活性劑，0℃～40℃條件下進行交聯反應，從而制得所述乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共交聯酶聚集體。

在另一優選例中，所述步驟(1)中，包括步驟：

在基因工程菌中共表達乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，從而獲得所述含有乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的混合物。