[發明專利]一種針對伏馬毒素B1的靈敏檢測方法

有效

• 申請號: 201610944743.3
• 申請日: 2016-11-02
• 公開（公告）號: CN106645686B
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 熊勇華;周耀峰;黃小林;李響敏;江湖;賴衛華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 劉華

本發明提供了一種針對伏馬毒素B₁的靈敏檢測方法，該方法利用包埋有量子點的熒光微球替代常規的酶載體與伏馬毒素B₁偶聯，以偶聯產物作為競爭抗原執行直接競爭ELISA。在技術路線中，本發明首先依據發光特性選擇了適宜的量子點，進一步設計了基于熒光微球技術的量子點包埋方法，在此基礎上，將量子點熒光微球經BSA包被后與伏馬毒素B₁偶聯，從而得到了性能更好的競爭性抗原。該技術方案中，熒光微球通過高聚物載體包埋了大量的量子點，因而具有更高的發光強度，可有效地提高檢測的靈敏度；而且，由于熒光微球具有較大的粒徑，因此可在一定程度上降低競爭抗原與包被抗體之間過高的親和力，從而提升檢測的靈敏度。

技術領域

本發明涉及抗原檢測技術領域，進一步涉及基于熒光免疫學分析的抗原檢測技術，具體涉及一種針對伏馬毒素B₁的靈敏檢測方法。

背景技術

伏馬毒素是一組主要由串珠鐮刀菌在一定溫度和濕度條件下繁殖所產生的真菌毒素，是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物，包括由20個碳原子組成的脂肪鏈及通過二個酯鍵連接的親水性側鏈。伏馬毒素存在的形式有FA₁、FA₂、FB₁、FB₂、FB₃、FB₄、FC₁、FC₂、FC₃、FC₄、FP₁等,其中以伏馬毒素B₁（FB₁）最為常見，毒性也最大。伏馬毒素可致馬大腦白質軟化癥，豬肺水腫和胸腔積水，還可引起靈長類動物的動脈粥樣硬化樣改變，誘發大鼠肝癌。在人類當中，伏馬毒素主要出現在玉米高消費的一些地區，部分地區的流行病學研究顯示，伏馬毒素與人類食道癌的發生密切相關。特別需要指出的是，作為世界主要糧食品種之一的玉米最容易感染串珠鐮刀菌和伏馬毒素，因此建立高靈敏、可靠的檢測方式檢測伏馬毒素B₁對人類健康有著非常重要的意義。

基于免疫學的快速篩查方法因具有通量高、檢測快速、成本低等優勢，近年來得到廣泛的推廣和應用。其中競爭酶聯免疫吸附法在小分子抗原的檢測中扮演了重要角色，常規競爭酶聯免疫吸附法采用辣根過氧化物酶催化四甲基聯苯胺顯色作為信號源，這種簡單的催化底物顯色作為信號導致了常規競爭酶聯免疫吸附法檢測范圍在μg/mL到ng/mL之間，遠遠滿足不了食品污染檢測pg/mL的檢測要求。目前，用于提高直接競爭免疫學分析方法檢測靈敏度的策略主要有兩個方面：一是提高檢測信號的靈敏度，如等離子共振免疫吸附法、化學發光免疫吸附法、拉曼散射免疫吸附法及熒光免疫吸附法等；二是降低競爭抗原與抗體的親和力，如化學合成結構類似物及生物合成模擬表位等。

在傳統直接競爭酶聯免疫吸附法中，競爭抗原的制備是通過將小分子半抗原與載體蛋白（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）偶聯。由于載體蛋白的尺寸較小，導致競爭抗原與相應抗體的親和力較高，無法被目標物所競爭。相對于載體蛋白，納米顆粒具有更大的尺寸和重量，在相同的溫度下，其布朗運動更慢。使用納米顆粒作為小分子半抗原的載體可以合成出親和力更低的競爭抗原，從而更容易被目標分析物競爭，進而獲得更高的檢測靈敏度。此外，使用納米材料替代蛋白作為競爭抗原的載體，有效地規避了傳統化學合成或生物合成抗原類似物的局限性，如操作復雜繁瑣、費時費力以及偶然性大等。基于上述技術優勢，納米顆粒的抗原載體受到了廣泛的關注，然而在載體的選擇方面，既應當考慮分子層面的偶聯效果，同時還應當具有良好的發光特性。近年來，量子點以其寬激發、窄發射、斯托克斯位移大和耐光漂白等優良的光學特性在免疫學分析中得到了廣泛應用，有研究者嘗試利用量子點代替常規載體HRP、ALP，然而實際研究中發現量子點與抗原的結合效果不理想，相應的發光性能難以保證，同時由于量子點本身性質不穩定，因此易受環境影響而發生熒光淬滅，此外，由于量子點的粒徑仍相對較小，因此一方面存在分離純化不方便的問題，另一方面仍會導致競爭抗原和抗體之間親和力過高的現象。

發明內容