[發明專利]一種高表達外源蛋白穩定細胞株的篩選方法

在審

• 申請號: 201610928023.8
• 申請日: 2016-10-31
• 公開（公告）號: CN108018302A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 應勖;倪寶富;柯蓓蕾;趙奕婷
• 申請（專利權）人: 三生國健藥業（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/67
• 分類號: C12N15/67
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明公開了一種高表達外源蛋白的穩定細胞株的篩選方法，包括以下步驟：(a)使用細胞周期調節劑處理細胞；(b)將包含外源蛋白的重組質粒導入經所述細胞周期調節劑處理的細胞；(c)篩選高表達外源蛋白的穩定細胞株。本發明的方法能夠有效地用于篩選高表達外源蛋白的穩定細胞株，并且操作簡便，成本低廉，不需要額外檢測雜蛋白，具有廣泛的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高表達外源蛋白的穩定細胞株的篩選方法。

背景技術

基因重組技術在重組蛋白制藥領域發展應用廣泛，用哺乳動物細胞表達的蛋白具有更近似于人體自身的蛋白修飾。該技術把攜帶目的基因的質粒轉染到宿主細胞中，經過多輪篩選后，得到穩定的細胞株，穩定表達目的蛋白，這在大規模工業生產中，能保證生產的一致性，和產品的一致性。但目前哺乳動物細胞的表達水平低，獲得穩定細胞株的篩選耗時長，造成生產成本高，是重組蛋白產業化中的限制因素。

為了獲得高單細胞產量的穩定生產細胞株，人們采用多種方式方法，包括優化表達載體，改造細胞等。袁武梅等利用增強子SP163-λ1基因提高重組干擾素的表達(袁武梅，麻粉蓮，張騫，等.干擾素λ1在CHO細胞中的表達[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2013,27(3)：190-192)，而來大志等通過整合Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因調控細胞生長狀態以提高細胞產率(來大志,翁少潔,齊連權,等.通過高表達Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因組合使CHO細胞適于在無蛋白培養基中抗凋亡培養[J].生物工程學報，2004，20(1)：66-72)。

然而以上這些方法需要從頭開始構建表達質粒，和/或宿主細胞的重新篩選，操作復雜，耗時較長，更重要的是，還需要對由此引入到最終產品中的雜蛋白進行詳細驗證，以保證是否可以安全應用到藥品生產。因此，有必要提供一種操作簡單、成本低廉的安全的高表達外源蛋白穩定細胞株的篩選方法。

發明內容

本發明涉及一種高表達外源蛋白的穩定細胞株的篩選方法。具體地說，該方法利用細胞周期調節劑使細胞群體處于G2/M期時，進行穩定轉染，穩定轉染后獲得的陽性細胞率高，細胞表達水平提高，能夠有效地提高高表達外源蛋白的穩定細胞株的篩選效率。

因此，本發明的目的在于提供一種高表達外源蛋白的穩定細胞株的篩選方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種高表達外源蛋白的穩定細胞株的篩選方法，其中，包括以下步驟：

(a)使用細胞周期調節劑處理細胞；

(b)將包含外源蛋白表達基因的重組質粒導入(a)經所述細胞周期調節劑處理的細胞中；

(c)篩選高表達外源蛋白的穩定細胞株。

本發明使用的細胞周期調節劑能夠使所述細胞處于G2/M期，如阿非迪霉素(aphidicolin)、MDK抑制劑Roscovitine。優選的，所述細胞周期調節劑為阿非迪霉素。優選的，所述阿非迪霉素的作用濃度為0-2μg/ml(不包含0μg/ml和2μg/ml)。更優選的，所述阿非迪霉素的作用濃度為0.5-1μg/ml。優選的，所述阿非迪霉素的作用時間為4-24小時。更優選的，所述阿非迪霉素的作用時間為8小時。

本發明使用的細胞為哺乳動物細胞，包括CHO細胞、293細胞，適用于表達目的外源蛋白。優選的，所述哺乳動物細胞為CHO細胞。更優選的，所述CHO細胞為CHO-S或DG44。

本發明中所述外源蛋白可包括抗體、融合蛋白、細胞因子，優選為抗體。更優選的，所述抗體為抗GPNMB抗體。

本發明使用的導入的方法可選用電穿孔轉染法或聚醚酰亞胺(PEI)轉染法。