[發(fā)明專利]基于微流控芯片的模擬藥物體內(nèi)代謝過程的肝-腎體系

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610893829.8
• 申請日: 2016-10-14
• 公開（公告）號: CN107955781B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦建華;郭雅瓊;李中玉;陶婷婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種模擬藥物肝代謝對腎臟影響的肝-腎體系微流控芯片，其特征在于：該微流控芯片主要由頂層芯片、多孔濾膜、底層芯片組成，多孔濾膜通過不可逆封接頂層芯片的下表面，封有頂層芯片的多孔濾膜下表面通過PDMS與底層芯片的上表面粘合封接；

頂層芯片由U形的頂層芯片主通道(1)和頂層芯片主通道入口(11)連接而成；

底層芯片由左側(cè)主通道(3)、右側(cè)主通道(6)、膠原通道(7)、膠原通道入口(8)、底層芯片左側(cè)主通道入口(9)以及底層芯片右側(cè)主通道入口(10)組成，膠原通道(7)左連左側(cè)主通道(3)，右連右側(cè)主通道(6)；所述底層芯片的左側(cè)主通道(3)為I形，所述底層芯片的右側(cè)主通道(6)為U型，所述底層芯片細(xì)胞膠原通道(7)為“豐”字形，在膠原通道中間的位置上為橫向結(jié)構(gòu)，膠原通道通過橫向結(jié)構(gòu)與左側(cè)主通道(3)和右側(cè)主通道(6)相連接，橫向結(jié)構(gòu)的數(shù)量為1～10個；膠原通道(7)與左側(cè)主通道(3)的交界為半球形界面(12)，膠原側(cè)為凹面；

頂層芯片主通道(1)通過多孔濾膜(5)下連底層芯片左側(cè)主通道(3)；底層芯片左側(cè)主通道(3)通過多孔濾膜(5)上連頂層芯片主通道(1)，右連膠原通道(7)；

所述底層芯片是由高度不同的兩部分組成，左側(cè)主通道(3)、右側(cè)主通道(6)高度為200-500μm，膠原通道(7)高度為80-200μm。

2.按照權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述芯片材料為可透光透氣的PDMS聚合物，PDMS單體與引發(fā)劑比例為5～10:1，多孔濾膜材料為聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔徑為0.01～10um。

3.一種基于微流控芯片的模擬藥物體內(nèi)代謝過程的肝-腎體系，其特征在于：采用權(quán)利要求1所述的微流控芯片，按照以下方法構(gòu)建而成：

(1)芯片預(yù)處理

設(shè)計制作芯片，用移液器將配制好的膠原工作液加入膠原通道，加1mL PBS緩沖液于培養(yǎng)皿中，將固定芯片的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中孵育30min，促使膠原由粘稠狀液體變?yōu)楣麅鰻钅z，凝膠過程結(jié)束后，細(xì)胞主通道加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液；

(2)細(xì)胞的接種與培養(yǎng)

肝細(xì)胞調(diào)整至1～5×10⁶cells/mL的細(xì)胞懸液，加入頂層芯片主通道，細(xì)胞貼附于多孔濾膜界面生長，將芯片平移放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h換液一次；

提取原代大鼠腎小球微組織，調(diào)整至10⁴～10⁵cells/mL的細(xì)胞懸液，取10μL細(xì)胞懸液加入左側(cè)主通道，左側(cè)主通道向上，膠原通道向下側(cè)立培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼附在底層芯片左側(cè)主通道與膠原通道的半球形界面，在光學(xué)顯微鏡下觀察可見腎小球微組織貼附于膠原界面生長，將芯片平移放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)、每隔24h換液一次；

(3)待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可進行后續(xù)試驗；觀察藥物經(jīng)代謝后對腎小球功能的影響及其他。

4.按照權(quán)利要求3所述一種基于微流控芯片的模擬藥物體內(nèi)代謝過程的肝-腎體系應(yīng)用，其特征在于：可采用權(quán)利要求3所述體系，對藥物毒性進行評價，具體過程如下：

(1)使用CCK-8試劑盒進行細(xì)胞活性的檢測，CCK-8試劑：細(xì)胞培養(yǎng)基的體積比為1:9，混合均勻成檢測工作液，加入底層芯片左側(cè)主通道，置培養(yǎng)箱中3小時后，轉(zhuǎn)入96孔板中，酶標(biāo)儀測定450nm處吸光度，用于對細(xì)胞活力進行定量，作為藥物毒性的指標(biāo)之一；

(2)乳酸脫氫酶(LDH)漏出，收集芯片通道內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，使用LDH試劑盒，操作檢測培養(yǎng)液LDH漏出濃度，用于觀察藥物對細(xì)胞的損傷程度，作為藥物毒性的指標(biāo)之一；

(3)免疫熒光，常規(guī)免疫染色操作，熒光顯微鏡觀察拍照，進行Live/Dead染色，觀察死活細(xì)胞數(shù)；ZO-1染色，觀察細(xì)胞緊密連接情況；F-actin染色，觀察細(xì)胞骨架蛋白等作為藥物毒性的指標(biāo)；

(4)蛋白濾過，使用白蛋白，加入左側(cè)主通道，1小時后，收集右側(cè)主通道培養(yǎng)液，白蛋白試劑盒操作檢測蛋白濃度，觀察中分子量白蛋白的濾過率，作為藥物對腎濾過功能影響的指標(biāo)；

(5)蛋白濾過，使用IgG，加入左側(cè)主通道，熒光顯微鏡下于0min、15min、30min、60min拍照，分析IgG滲透性，觀察高分子量蛋白的濾過率，作為藥物對腎濾過功能影響的指標(biāo)。