[發(fā)明專利]一種細胞吞噬纖維粉塵的檢測方法及應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2016-10-13
• 公開（公告）號: CN106568700B
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張敏;朱麗瑾;武為;陳鈞強;蔣兆強
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發(fā)明公開了一種細胞吞噬纖維粉塵粉塵的檢測方法及應(yīng)用。采用無毒的細胞膜脂溶性熒光探針對細胞進行預(yù)處理，在熒光顯微鏡下進行觀察獲得進入細胞內(nèi)部的纖維粉塵粉塵的顯示結(jié)果，可采用DiD、DiO、DiI、DiR或者DiS，探針染在細胞膜和細胞膜的其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)上，進入細胞膜后在整個細胞膜上擴散，纖維粉塵進入細胞膜的部分在熒光顯微鏡下觀察顯示為熒光，從而檢測獲得細胞吞噬纖維粉塵的結(jié)果。本發(fā)明方法簡單而有效，簡化了檢測細胞吞噬纖維粉塵的檢測方法，提高了檢測效率，節(jié)約成本適于推廣，解決了現(xiàn)有傳統(tǒng)方法中存在無法檢測和檢測范圍小的弊端和問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細胞吞噬纖維粉塵的檢測方法及應(yīng)用，屬于細胞技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在大多數(shù)高等動物細胞中，吞噬作用是一種保護機體免受外損傷的基本的防衛(wèi)機制之一。眾所周知巨噬細胞和中性粒細胞是機體主要的吞噬細胞。它們通過吞噬菌體和消滅感染的細菌、病毒以及損傷的細胞、衰老的紅細胞等。近年的研究表明除了巨噬細胞和中性粒細胞外，很多機體細胞都有一定的吞噬功能，具有吞噬細胞吞噬能力的特質(zhì)，吞噬的物質(zhì)多為顆粒性的，如微生物、組織掉片和異物等。近幾年研究發(fā)現(xiàn)細胞對進入呼吸道和機體的纖維粉塵都有吞噬作用。

本技術(shù)以細胞吞噬纖維粉塵為例開展。以往檢測細胞吞噬的研究中，多使用掃描電子顯微鏡結(jié)合透射電子顯微鏡等方法來發(fā)現(xiàn)，其操作過程復(fù)雜，需要十幾個步驟，而且隔天上機檢查，費用高且耗時間，更重要的是掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡因為價格昂貴、占據(jù)空間比較大而且需要專門配一個操作人員操作儀器，因此不是每個單位都有這個儀器，有時候需要借用其他單位的儀器，需要預(yù)約，通過預(yù)約安排自己的實驗，大大影響了科學(xué)實驗的進程，即使買了掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡，維護也是很大一筆開銷。另外，細胞個體極薄(<1μm)，掃描電子顯微鏡在高放大倍數(shù)下可以明確一些細胞是否被吞噬，但有時候也很難區(qū)別和確定纖維粉塵在細胞內(nèi)和還是細胞下面，如果在細胞下面也會誤認為細胞吞噬了纖維。透射電子顯微鏡可以看見細胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和變化，能很明確細胞是否吞噬了纖維粉塵，但是由于放大倍數(shù)高，很難有全局觀，很難觀察上百個細胞的吞噬情況和觀察細胞吞噬纖維粉塵的比例。所以通常需要通過透射電子顯微鏡和掃描電鏡相結(jié)合的方法觀察，明確有無細胞吞噬現(xiàn)象和細胞吞噬異物的比例。但是這種分別做兩種檢測，不能對同一個細胞進行檢測，因為兩種儀器對細胞的處理方法和步驟不一樣，所以用同一種處理的平行樣本而不是同一樣本在兩個儀器上觀察，這樣結(jié)果可能有些差異。這個方法解決了這兩種儀器的弊端，既可以明確有無細胞吞噬纖維粉塵，又可以明確細胞吞噬纖維粉塵的比例。

因此，現(xiàn)有技術(shù)中掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡等方式采用的檢測過程非常復(fù)雜，不僅前期細胞的培養(yǎng)需要有薄玻片、培養(yǎng)條件等特定要求，而且檢測過程中還需要固定和鍍金等，并且在觀察窗口的尺寸上比較小，一個視野只能一次性觀察10左右細胞的范圍，方法復(fù)雜而且存在眾多弊端。如果不用這些大型儀器，僅用普通顯微鏡的白光觀察細胞吞噬纖維粉塵是無法分辨纖維粉塵是粘附在細胞表面，還是已經(jīng)被細胞吞噬了，還是一根較長的纖維粉塵位于兩個細胞上，一個細胞吞噬，另一個細胞只是粘附著，還是兩個細胞都吞噬或者都沒有吞噬，是無法判定的。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提出了一種細胞吞噬纖維粉塵的檢測方法及應(yīng)用，這是一種簡單而有效的檢測細胞吞噬纖維粉塵的科學(xué)研究方法。

其特征是利用市面上銷售的無毒的細胞膜脂溶性熒光探針標記細胞，用纖維粉塵刺激細胞后，在熒光顯微鏡的明場(也就是普通白光)和熒光相下分別觀察纖維粉塵。當細胞膜被標記后，進入細胞內(nèi)的纖維粉塵可以在熒光鏡下顯示，沒有進入細胞的纖維粉塵沒有熒光，就可以檢測細胞吞噬纖維粉塵比例，用于科學(xué)研究細胞的吞噬能力和計算細胞吞噬纖維粉塵的比例，以及不同藥物處理后細胞觀察細胞吞噬纖維粉塵的情況。

本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案是：

一、一種細胞吞噬纖維粉塵的檢測方法：