[發明專利]一種耐熱細胞溶解素及其在煙草薄片制備工藝中的應用

有效

• 申請號: 201610893201.8
• 申請日: 2016-10-13
• 公開（公告）號: CN106434724B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 葉建斌;楊雪鵬;馬科;楊峰;樊新順;閆記;聶晶晶;楊宗燦
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;A24B3/14
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙)41122
• 代理人: 張愛軍

技術領域

本發明涉及一種細胞溶解素，特別涉及一種耐熱細胞溶解素及其在煙草薄片制備工藝中的應用。

背景技術

煙草薄片又稱重組煙葉、均質煙葉。主要由煙末、碎片、煙梗或低次煙葉加入膠粘劑和其他添加劑等組成。煙草薄片可作為煙制品原料，用來代替天然的雪茄內包葉，現已廣泛用作卷煙原料。煙草薄片的制備方法主要有造紙法、稠漿法和輥壓法3種。其中，造紙法的應用最為廣泛。造紙法是將煙草原料先用水浸提，不溶性物質打漿、抄造制成基片，浸提液濃縮涂布至基片上，再干燥即得。由于在造紙法制備煙草薄片過程中，直接將濃縮后的萃取液直接浸涂或噴涂到薄片片基上，濃縮后的萃取液中的大分子化合物，如蛋白質、淀粉等化學成份，在制備過程中幾乎不發生變化，且煙草廢棄料具有先天性缺陷，如缺少卷煙特征香氣、煙草香氣淡、雜氣、木質氣較重、喉部干燥感和舌部刺辣感明顯等，因此將這些原料加入卷煙配方后會顯著降低卷煙等級。

國內目前主要通過在煙草物料萃取過程中酶解或在濃縮液中加料加香來改善煙草薄片吃味差等缺點。酶解主要是利用降解酶對煙草原料中的大分子物質進行降解。但是由于煙草浸提過程中的高溫工藝影響了降解酶的活性，因此再造煙葉浸提液過程中，普通的降解酶幾乎難以發揮其原有的活性功能。但是由于高溫降解酶的成本較高，且煙草原料中大分子物質的種類較多，因此采用多種耐高溫降解酶輔助煙草萃取時，存在操作繁瑣、成本較高，降解效果不理想的問題。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種耐熱細胞溶解素及其在煙草薄片制備工藝中的應用，該耐熱細胞溶解素能夠有效降低浸提液中的蛋白質含量，提高可溶性總糖含量，并降低制備成型的煙草薄片的木質素含量。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種耐熱細胞溶解素，將耐熱細胞溶解素基因克隆到大腸桿菌中，再通過藍白斑篩選含有該耐熱細胞溶解素基因的陽性克隆子，最后對陽性克隆子進行誘導表達，即得。

所述的耐熱細胞溶解素基因為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一種利用耐熱細胞溶解素制備煙草薄片的方法，包括以下步驟：

(1)在煙草原料中加入水和含有耐熱細胞溶解素的溶液，在55-75℃條件下浸提1-2h，過濾，得到一級浸提液和一級煙草固體物；

(2)在一級煙草固體物中加入水和含有耐熱細胞溶解素的溶液，在55-75℃條件下浸提5-10min，過濾，得到二級浸提液和二級煙草固體物；

(3)重復步驟(2)，得到三級浸提液和三級煙草固體物；

(4)合并一級浸提液、二級浸提液和三級浸提液，離心除去雜質，取上清液濃縮至26波美度，得到煙草浸提濃縮液；

(5)將三級煙草固體物打漿、抄造，制得煙草薄片片基，再將煙草浸提濃縮液涂布至煙草薄片片基上，干燥，制得煙草薄片。

步驟(1)中煙草原料與水的固液比為1:5-6，步驟(2)中一級煙草固體物與水的固液比為1:5-6。

步驟(1)中含有耐熱細胞溶解素的溶液的用量為煙草原料與水總體積的1/500-1/200；步驟(2)中含有耐熱細胞溶解素的溶液的用量為一級煙草固體物與水總體積的1/500-1/200。

所述的含有耐熱細胞溶解素的溶液的制備方法為：

(1)將耐熱細胞溶解素基因連接至載體，構建重組質粒；

(2)將重組質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞中，通過藍白斑篩選含有該耐熱細胞溶解素基因的陽性克隆子；

(3)將陽性克隆子單菌落接種至LB液體培養基5ml中，37℃培養過夜，得到大腸桿菌菌液，﹣20℃保存備用；

(4)將﹣20℃保存的大腸桿菌菌液10μl接種至LB液體培養基100ml中，37℃培養過夜；

(5)將步驟(4)培養過夜的菌液2ml接種至LB液體培養基2000ml中，37℃振蕩培養至菌液OD₆₀₀為0.6，降溫至18℃；

(6)在步驟(5)的菌液中加入IPTG至IPTG終濃度為0.5mM，18℃繼續振蕩培養至OD₆₀₀達到1.0，離心，收集菌體沉淀；

(7)將菌體沉淀懸浮于50ml預冷的NTA-0緩沖液中，冰浴，超聲破碎菌體，離心，收集上清液，即得。

所述的耐熱細胞溶解素基因為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述的三級煙草固體物打漿的溫度為40℃。

本發明的有益效果：