[發明專利]一種耐熱細胞溶解素及其在煙草薄片制備工藝中的應用

有效

• 申請號: 201610893201.8
• 申請日: 2016-10-13
• 公開（公告）號: CN106434724B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 葉建斌;楊雪鵬;馬科;楊峰;樊新順;閆記;聶晶晶;楊宗燦
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;A24B3/14
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙)41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種利用耐熱細胞溶解素制備煙草薄片的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在煙草原料中加入水和含有耐熱細胞溶解素的溶液，在55-75℃條件下浸提1-2h，過濾，得到一級浸提液和一級煙草固體物；

（2）在一級煙草固體物中加入水和含有耐熱細胞溶解素的溶液，在55-75℃條件下浸提5-10min，過濾，得到二級浸提液和二級煙草固體物；

（3）重復步驟（2），得到三級浸提液和三級煙草固體物；

（4）合并一級浸提液、二級浸提液和三級浸提液，離心除去雜質，取上清液濃縮至26波美度，得到煙草浸提濃縮液；

（5）將三級煙草固體物打漿、抄造，制得煙草薄片片基，再將煙草浸提濃縮液涂布至煙草薄片片基上，干燥，制得煙草薄片；

所述的含有耐熱細胞溶解素的溶液的制備方法為：

（1）將耐熱細胞溶解素基因連接至載體，構建重組質粒；

（2）將重組質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞中，通過藍白斑篩選含有該耐熱細胞溶解素基因的陽性克隆子；

（3）將陽性克隆子單菌落接種至LB液體培養基5ml上，37℃培養過夜，得到大腸桿菌菌液，﹣20℃保存備用；

（4）將﹣20℃保存的大腸桿菌菌液10μl接種至LB液體培養基100ml中，37℃培養過夜；

（5）將步驟（4）培養過夜的菌液2ml接種至LB液體培養基2000ml中，37℃振蕩培養至菌液OD₆₀₀為0.6，降溫至18℃；

（6）在步驟（5）的菌液中加入IPTG至IPTG終濃度為0.5mM，18℃繼續振蕩培養至OD₆₀₀達到1.0，離心，收集菌體沉淀；

（7）將菌體沉淀懸浮于50ml預冷的NTA-0緩沖液中，冰浴，超聲破碎菌體，離心，收集上清液，即得；

所述的耐熱細胞溶解素基因為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的利用耐熱細胞溶解素制備煙草薄片的方法，其特征在于，步驟（1）中煙草原料與水的固液比為1:5-6，步驟（2）中一級煙草固體物與水的固液比為1:5-6。

3.根據權利要求1所述的利用耐熱細胞溶解素制備煙草薄片的方法，其特征在于，步驟（1）中含有耐熱細胞溶解素的溶液的用量為煙草原料與水總體積的1/500-1/200；步驟（2）中含有耐熱細胞溶解素的溶液的用量為一級煙草固體物與水總體積的1/500-1/200。

4.根據權利要求1所述的利用耐熱細胞溶解素制備煙草薄片的方法，其特征在于，所述的三級煙草固體物打漿的溫度為40℃。