[發(fā)明專利]一種零背景的平末端克隆載體pRI857及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610892336.2
• 申請日: 2016-10-12
• 公開（公告）號: CN107937426A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪洋;張開;易軍;蘇會娟;楊慕晗
• 申請（專利權(quán)）人: 南京理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 南京理工大學(xué)專利中心32203
• 代理人: 劉海霞,朱顯國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種零背景的平末端克隆載體pRI857及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，具體涉及一種用溫敏型啟動子cI857-P_R控制抗性基因Kan^R的表達(dá)以此作為篩選標(biāo)記的pRI857克隆載體及其在基因克隆和基因文庫構(gòu)建中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的DNA片段，利用體外重組的方式，將DNA序列插入到克隆載體中，實現(xiàn)目的基因的異源表達(dá)，在醫(yī)學(xué)，工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上取得了重要的成就，也給生物技術(shù)的發(fā)展開辟了一條新的道路。同時，由于生物信息學(xué)的突飛猛進(jìn)，二代測序技術(shù)的問世，這樣，陽性克隆的篩選顯得尤為重要，而有效的篩選手段是對DNA序列測定和后續(xù)基因功能驗證的必須手段。利用LacZ作為篩選標(biāo)記的藍(lán)白斑篩選系統(tǒng)，通過產(chǎn)生β-半乳糖苷酶將x-gal分解為半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)，有色物質(zhì)可以使細(xì)菌呈藍(lán)色(Langley,K.E.；et al.(1975)."Molecular basis of beta-galactosidase alpha-complementation".Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.72(4):1254–1257.)；而陽性克隆則由于外源基因的插入，破壞了LacZ的閱讀框，使得β-半乳糖苷酶無法正確表達(dá)，不能產(chǎn)生藍(lán)色的5-溴-4-靛藍(lán)，故菌落呈白色，通過顏色的差異可以輕易的挑選出正確克隆。然而這種方法有時候會因為有些空載體也顯白色，故而也存在限制。

溫敏型啟動子P_R、P_L啟動子來至于λ噬菌體，受cI857基因的嚴(yán)格調(diào)控，30℃下阻遏PR啟動子轉(zhuǎn)錄，隨著溫度的提高，阻遏蛋白cI857與P_R啟動子的結(jié)合逐漸減弱，P_R啟動子的轉(zhuǎn)錄則不斷提高(Villaverde A,et al.Fine regulation of cI857-controlled gene expression in continuous culture of recombinant Escherichia coli by temperature[J].Applied and environmental microbiology,1993,59(10):3485-3487.)。當(dāng)溫度達(dá)到37℃時，阻遏蛋白cI857對PR啟動子的抑制能力減弱，使得PR啟動子能驅(qū)動抗性基因的表達(dá)，通過這一技術(shù)來進(jìn)行分子克隆，可以獲得100％的陽性克隆。

發(fā)明內(nèi)容

針對基因克隆中的實際問題和需求，本發(fā)明提供了一種零背景的平末端克隆載體pRI857，該零背景平末端快速克隆載體是利用阻遏子cI857和溫敏型啟動子P_R來控制抗生素基因Kan^R的表達(dá)以此作為篩選標(biāo)記的pRI857克隆載體，可以高效克隆平末端PCR產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA片段。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種重組質(zhì)粒pBBR1MCS-PR，為利用PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pCP20中的P_R啟動子基因替換pBBR1MCS-2質(zhì)粒中的Kan^R的啟動子序列，形成全長序列為SEQ ID NO.15的重組質(zhì)粒。

一種重組質(zhì)粒pUC-cI857，為利用PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pCP20中的cI857基因替換pUC19中的LacZa基因，形成全長序列為SEQ ID NO.16的重組質(zhì)粒。

一種零背景的平末端克隆載體pRI857，為利用PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pUC-cI857中的Plac-cI857基因和重組質(zhì)粒pBBR1MCS-PR中的P_R-Kan^R基因替換質(zhì)粒pKV6中的AmpR和ermB-ermA基因，P_R-Kan^R基因，Plac-cI857基因與質(zhì)粒pKV6中的dbl-colE1基因順序連接形成全長序列為SEQ ID NO.17的重組質(zhì)粒，所述的cI857開放閱讀框上設(shè)計有BfrBI平末端酶切位點。