[發明專利]基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學發光免疫傳感器的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201610888938.0
• 申請日: 2016-10-12
• 公開（公告）號: CN106568936B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 盧靜;郭智勇;胡宇芳;沙玉紅;武琳;俞欣辰;郭富米
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙)33226
• 代理人: 何仲

技術領域

本發明涉及一種電化學發光免疫傳感器及其檢測方法，尤其是涉及一種基于多功能化二硫化鉬材料的miRNA-21電化學發光免疫傳感器的制備方法及其應用，屬于功能材料和生物傳感技術領域。

背景技術

癌癥，也稱惡性腫瘤，本質上是一種多基因疾病，是由細胞生長增殖機制失常引起的疾病，嚴重危害人類的健康。據WHO報告與預測，全球癌癥病例將呈現迅猛增長態勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年將達到2400萬人。腫瘤專家認為，實現對腫瘤的早期發現、早期診斷、早期治療，可以有效地預防癌癥，其中早期診斷是關鍵。腫瘤標志物的發現使得早期診斷成為可能。腫瘤標志物是在腫瘤的發生和增殖過程中產生、反映腫瘤存在和生長的一類物質，因此，檢測腫瘤標志物對癌癥患者有極其重要的意義。研究發現，人體的很多腫瘤中都存在miRNA的差異表達，在這些差異表達中miRNA-21較為特殊，高表達的miRNA-21發揮著原癌基因的作用，一旦被激活，就會誘導或促進腫瘤的發生發展，因此，miRNA-21可作為有效的腫瘤標志物。

目前miRNA-21的檢測方法主要有Northern印跡分析、微陣列芯片法、實時熒光定量PCR法和原位雜交法等。Northern印記分析操作繁瑣、耗時長、靈敏度低，檢測時需要大量樣品，并且對RNase污染非常敏感，實驗中每一步操作不當都會影響實驗結果；實時熒光定量PCR的低選擇性和非線性目標的放大可能會導致基因表達的失真，只能用來量化miRNA前體的表達，而不能量化成熟的miRNA表達；微陣列芯片制作和檢測費用很高，芯片上可利用體積很小，導致靈敏度不高。因此，建立一種靈敏、準確、快速、簡便的miRNA-21檢測方法是迫切需求。

電化學發光免疫分析方法是電化學發光和免疫分析相結合的產物，它具有靈敏度高、響應快速、選擇性強、重現性好、易于操作、步驟簡單等優點，具有良好的應用前景。二硫化鉬（MoS₂）是一類與石墨烯有著類似結構的層狀無機化合物，具有較大的比表面積、良好的導電性以及較好的化學穩定性，其在電化學發光免疫傳感器方面受到關注。目前，國內外還沒有關于基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學發光免疫傳感器的制備方法及其應用的相關研究報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種靈敏度高，特異性強、準確性高以及操作步驟簡單，實驗成本低的基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學發光免疫傳感器的制備方法及其應用。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學發光免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）Fe₃O₄@Au磁性納米顆粒的制備

a. 制備Fe₃O₄磁性納米顆粒：將0.7～1.0 g FeCl₃·6H₂O和0.2～0.5 g FeCl₂·4H₂O溶于50～100 mL的二次水后加入到三口燒瓶中，通氮氣，磁力攪拌混合均勻，溫度升高到80～100℃，向三口燒瓶中緩慢滴加20～25wt%的氨水，調節pH=9～10，繼續加熱攪拌1～2 h后，停止加熱，在氮氣的保護下，攪拌回流，冷卻至室溫，制備得到的黑色沉淀物即為Fe₃O₄磁性納米顆粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50 mL；

b. 制備氨基化的Fe₃O₄磁性納米顆粒：將步驟a所制備的Fe₃O₄磁性納米顆粒溶液超聲0.5～1 h，加入0.2～0.3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），攪拌4～5 h，加入1～2 mL 0.1～0.5 mol/L硝酸溶液，繼續攪拌3～4 h后，得到氨基化的Fe₃O₄磁性納米顆粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100 mL；