[發明專利]基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學發光免疫傳感器的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201610888938.0
• 申請日: 2016-10-12
• 公開（公告）號: CN106568936B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 盧靜;郭智勇;胡宇芳;沙玉紅;武琳;俞欣辰;郭富米
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙)33226
• 代理人: 何仲

1.一種基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學發光免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)Fe₃O₄@Au磁性納米顆粒的制備

a.制備Fe₃O₄磁性納米顆粒：將0.7～1.0g FeCl₃·6H₂O和0.2～0.5g FeCl₂·4H₂O溶于50～100mL的二次水后加入到三口燒瓶中，通氮氣，磁力攪拌混合均勻，溫度升高到80～100℃，向三口燒瓶中緩慢滴加20～25wt％的氨水，調節pH＝9～10，繼續加熱攪拌1～2h后，停止加熱，在氮氣的保護下，攪拌回流，冷卻至室溫，制備得到的黑色沉淀物即為Fe₃O₄磁性納米顆粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50mL；

b.制備氨基化的Fe₃O₄磁性納米顆粒：將步驟a所制備的Fe₃O₄磁性納米顆粒溶液超聲0.5～1h，加入0.2～0.3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌4～5h，加入1～2mL 0.1～0.5mol/L硝酸溶液，繼續攪拌3～4h后，得到氨基化的Fe₃O₄磁性納米顆粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100mL；

c.制備Fe₃O₄@Au磁性納米顆粒：將5～10mL步驟b所制備的氨基化的Fe₃O₄磁性納米顆粒溶液和10～20mL 1wt％HAuCl₄在60～100kHz的超聲頻率下混合，攪拌1h后，緩慢加入30～50mL 20～30mmol/L檸檬酸三鈉溶液，超聲2～3h，得到Fe₃O₄@Au磁性納米顆粒，二次水清洗，定容至20mL；

(2)信號單元的合成

a.制備單片層MoS₂：稱取0.8～1g MoS₂粉末加入高壓釜，隨后加入30～35mL 0.4～0.5mol/L的正丁基鋰正己烷溶液，將高壓釜密封后放在100℃真空干燥箱中反應4～5h，獲得的產物過濾洗滌，在60℃真空烘箱中干燥得到鋰離子插層的二硫化鉬；取0.1～0.2g鋰離子插層的二硫化鉬分散在200～300mL水中，室溫下超聲4～5h，得到單分子層的MoS₂水溶液，冷凍干燥后得到MoS₂粉末；

b.制備羧基化MoS₂：將0.04～0.05g步驟a所制備的MoS₂粉末加入到40～50mL 30～40mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超聲儀中超聲2～3h，低速離心除去未完全剝離的MoS₂，最終獲得羧基化的MoS₂納米片層；

c.合成信號單元：取100～200μL 1～2mg/mL羧基化的MoS₂納米片層溶液超聲1h，加入200～400μL偶聯試劑，混合均勻，用0.5～1.0mol/L鹽酸調節溶液pH為4～6，常溫震蕩30～40min，離心洗滌去除上清液，取沉淀定容至200～300μL；加入20～30μL 1～5μmol/L信號DNA溶液和20～30μL 0.05～0.1mol/L魯米諾溶液，用1～2mol/L氫氧化鈉調節溶液pH為9～10，混合均勻，常溫震蕩3～4h；最后加入10～20μL 10～20mmol/L巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點，繼續震蕩1～2h，用二次水清洗離心去除上清液，最后將沉淀分散在雜交緩沖液中定容至30～50μL，即得到信號單元溶液；

(3)捕獲單元的合成

取50～100μL Fe₃O₄@Au溶液超聲5～10min，加入20～50μL 1～5μmol/L捕獲DNA溶液，用DNA固定緩沖液定容至200μL，混合均勻，37℃下震蕩3～4h，暗處放置24h；然后滴加10～20μL 10～20mmol/L巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點，用水清洗離心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100μL，即得到捕獲單元溶液，4℃下保存備用；

(4)電化學發光免疫傳感器組裝

a.將直徑為3～5mm磁性玻碳電極依次用0.1、0.3、0.05μmol/L Al₂O₃漿拋光成鏡面，依次用無水乙醇、蒸餾水超聲波清洗，N₂吹干；

b.取5～10μL捕獲單元溶液滴涂于上述預處理過的磁性玻碳電極表面，通過磁性作用，捕獲單元即被牢固地吸附在電極表面，然后將5～10μL miRNA-21溶液滴涂在電化學發光免疫傳感器上，置于37℃中孵育1～2h，清洗；再取5～10μL步驟(2)所得的信號單元溶液，置于37℃中孵育1～2h后，清洗得到基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學發光免疫傳感器。