[發明專利]羊乳蛋白質組比對方法

有效

• 申請號: 201610882667.8
• 申請日: 2016-10-10
• 公開（公告）號: CN106645604B
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 翁秀秀;李發弟;樂祥鵬;李萬宏;劉欣欣
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: G01N33/04
• 分類號: G01N33/04;G01N1/28
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙) 11341
• 代理人: 李濤

1.一種羊乳蛋白質組比對方法，其特征在于，所述方法包括：

a.奶樣采集：隨機選擇多只胎次相同、預產期相近母羊，分別采集得到初乳奶樣和常乳奶樣，保存備用；

b.溶液配制：

使用尿素、硫脲、CHAPS和超純水配制水化上樣緩沖液；

使用尿素、SDS、Tris-HCl、甘油和超純水配制膠條平衡緩沖液母液；

使用所述膠條平衡緩沖液母液，添加DTT配制膠條平衡緩沖液I；

使用所述膠條平衡緩沖液母液，添加碘乙酰胺配制膠條平衡緩沖液II；

使用低熔點瓊脂糖、Tris、甘氨酸、SDS、溴酚藍和超純水配制低熔點瓊脂糖封膠液；

使用丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和超純水配制質量分數為30％的聚丙烯酰胺溶液；

使用Tris、超純水和鹽酸配制1.5mol/L Tris-HCl緩沖液和1mol/L Tris-HCl緩沖液；

使用SDS和超純水配制質量分數為10％的SDS溶液；

使用APS和超純水配制質量分數為10％的APS溶液；

使用Tris、甘氨酸、SDS和蒸餾水制備1倍稀釋的TBE電泳緩沖液；

使用所述10％的SDS溶液、溴酚藍、50％甘油、DTT、Tris-HCl制備5倍稀釋的上樣緩沖液；

使用乙醇、乙酸和加超純水制備卡諾氏固定液；

使用考馬斯亮藍G-250、無水乙醇、硫酸銨、磷酸和蒸餾水制備考馬斯亮藍G-250染色液；

c.脫脂乳蛋白樣品的制備：將多只母羊的所述初乳奶樣和所述常乳奶樣分別等體積混合，離心后棄去漂浮的乳脂肪層，獲得初乳脫脂乳蛋白樣品和常乳脫脂乳蛋白樣品，用離心管分裝，-20℃冷凍保存備用；

d.樣品蛋白質濃度測定：用BCA試劑盒，PBS為空白，以5.0mg/mL BSA為標準蛋白，在波長為560nm下用酶標儀測定樣品蛋白OD值，獲得所述初乳脫脂乳蛋白樣品和所述常乳脫脂乳蛋白樣品的蛋白質濃度；

e.二維凝膠電泳：依次經過等電聚焦電泳操作、膠條平衡、SDS-PAGE垂直凝膠電泳和膠圖采集與分析，得到所述初乳奶樣和所述常乳奶樣的2-DE圖譜；

所述SDS-PAGE垂直凝膠電泳為：

（1）配制質量分數為12％的丙烯酰胺凝膠，將凝膠溶液注入灌膠器中，上面留出約1cm的空間，用無水乙醇封膠面，保持膠面平整；

（2）待凝膠凝固后，倒去無水乙醇，并用蒸餾水沖洗膠面；然后用濾紙吸去凝膠上方多余液體；

（3）處理好后，將凝膠板放在桌面上，長玻璃板在下面，短玻璃板在上面；用鑷子夾住平衡好的膠條一端，并使膠面朝上放在長玻璃板上；用鑷子緩慢向下推動膠條的塑料支撐膜，必要時滴加少量電泳緩沖液潤滑，直至膠條與聚丙烯酰胺凝膠的膠面完全接觸粘合，且接觸面無任何氣泡和雜質；

（4）將低熔點瓊脂糖封膠液加熱溶解，待溫度下降后，滴加于放有膠條的凝膠上方，并確保膠條底部無氣泡存在；

（5）待封膠液充分凝固后，轉移至電泳槽中，并檢查漏液與否；

（6）向電泳槽內加入1倍稀釋的電泳緩沖液后，開啟循環水浴；接通電源，設置電泳程序，進行電泳；

（7）電泳結束后，取出凝膠架，取下玻璃板；撬開兩層玻璃，輕輕取出凝膠，切角標記；隨后進行凝膠固定、考馬斯亮藍染色，最后用蒸餾水給凝膠脫色至背景清晰。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述初乳奶樣為母羊產后的第1d收集的奶樣，所述常乳奶樣為母羊產后的第14天收集的奶樣，保存溫度為-20℃。