[發明專利]一種煙草AKT1基因及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610880287.0
• 申請日: 2016-10-09
• 公開（公告）號: CN107012151A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 任學良;魯黎明;李立芹;郭玉雙;張潔
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 李娜

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種煙草AKT1基因及其制備方法和應用。

背景技術

鉀離子通道是允許鉀離子特異通透質膜的離子通道，而阻礙其他離子通透-特別是鈉離子。這些通道一般由兩部分組成：一部分是通道區，選擇并允許鉀離子通過，而阻礙鈉離子；另一部分是門控開關，根據環境中的信號而開關通道。

現有技術對于鉀離子通道基因的研究在模式植物擬南芥中比較廣泛，例如，研究表明擬南芥鉀通道基因AKT1編碼一個內向整流通道，可以形成同源多聚體，主要在擬南芥根的表皮和皮層細胞中表達(Basset et al.,1995；Lagarde et al.,1996)；AKT1負責介導擬南芥根細胞從土壤中吸收鉀營養，AKT1的功能缺失造成akt1突變體植株K⁺吸收能力降低，從而使得akt1突變體冠部的K⁺含量顯著降低，導致幼苗在低鉀脅迫下表現出冠部失綠黃化的低鉀敏感表型(Lagarde et al.,1996；Hirsch et al.,1998；Spalding et al.,1999；Xu et al.,2006)。

煙草是一種耗鉀量很大的作物，煙葉鉀含量是衡量煙葉品質的的重要指標，目前，對于煙草中鉀離子通道的研究較少，煙草AKT1的功能未知。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供煙草AKT1基因及其制備方法和應用。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種煙草AKT1基因，所述AKT1基因的序列如Seq ID No.1所示。

本發明提供了上述技術方案所述AKT1基因的制備方法，包括以下步驟：設計PCR擴增引物，所述的PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列為：5’-ATGCCGTTGCCAGAGACACCGA-3’，所述的反向引物的核苷酸序列為5’-TCAAAAGATATACAAGCGATC-3’；提取煙草細胞總RNA；合成煙草細胞的cDNA；以所述煙草細胞cDNA為模板進行AKT1基因的PCR擴增，得到目的片段，測序后得到AKT1基因序列。

優選的，所述PCR擴增引物的設計是以NCBI Reference Sequence:

XM_009802835.1為參考序列，使用軟件primer 5設計得到的，所述

XM_009802835.1的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

優選的，所述的PCR擴增的體系為20μL體系，包括Premix ExTaq 10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，煙草細胞cDNA 1μL，ddH₂O8μL。

優選的，所述的PCR擴增的反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個循環。

優選的，所述的目的片段在測序之前還包括，將所述目的片段導入大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行菌落PCR驗證，驗證為陽性克隆后進行測序。

優選的，所述菌落PCR驗證使用的正向引物核苷酸序列為：5’-ATGCCGTTGCCAGAGACACCGA-3’，菌落PCR驗證使用的反向引物核苷酸序列為：5’-TCAAAAGATATACAAGCGATC-3’。

優選的，所述菌落PCR驗證的體系為10μL，包括Premix ExTaq 5μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，ddH₂O 4μL。

本發明還提供了一種煙草AKT1基因在促進煙草植株鉀離子吸收和轉運方面的應用。

優選的，將所述的煙草AKT1基因轉入到煙草植株中，使AKT1基因超量表達以提高煙草植株的煙葉中鉀離子的含量。