[發明專利]一種煙草AKT1基因及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610880287.0
• 申請日: 2016-10-09
• 公開（公告）號: CN107012151A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 任學良;魯黎明;李立芹;郭玉雙;張潔
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 李娜

1.一種煙草AKT1基因，其特征在于，所述AKT1基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

2.權利要求1所述的煙草AKT1基因的制備方法，包括以下步驟：

設計PCR擴增引物，所述的PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列為：5’-ATGCCGTTGCCAGAGACACCGA-3’，所述的反向引物的核苷酸序列為5’-TCAAAAGATATACAAGCGATC-3’；

提取煙草細胞總RNA；

合成煙草細胞cDNA；

以所述煙草細胞cDNA為模板進行AKT1基因的PCR擴增，得到目的片段，測序后得到AKT1基因。

3.根據權利要求2所述的煙草AKT1基因的制備方法，其特征在于，所述PCR擴增引物的設計是以NCBI Reference Sequence:XM_009802835.1為參考序列，使用軟件primer 5設計得到的，所述XM_009802835.1的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

4.根據權利要求2所述的煙草AKT1基因的制備方法，其特征在于，所述的PCR擴增的體系為20μL體系，包括Premix ExTaq 10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，煙草細胞cDNA 1μL，ddH₂O 8μL。

5.根據權利要求2或4所述的煙草AKT1基因的制備方法，其特征在于，所述的PCR擴增的反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個循環。

6.根據權利要求2所述的煙草AKT1基因的制備方法，其特征在于，所述的目的片段在測序之前還包括：將所述目的片段導入大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行菌落PCR驗證，驗證為陽性克隆后進行測序。

7.根據權利要求6所述的煙草AKT1基因的制備方法，其特征在于，所述菌落PCR驗證使用的正向引物的核苷酸序列為：5’-ATGCCGTTGCCAGAGACACCGA-3’，所述菌落PCR驗證使用的反向引物的核苷酸序列為：5’-TCAAAAGATATACAAGCGATC-3’。

8.根據權利要求6所述的煙草AKT1基因的制備方法，其特征在于，所述菌落PCR驗證的體系為10μL，包括Premix ExTaq 5μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，ddH₂O 4μL。

9.權利要求1所述的煙草AKT1基因在促進煙草植株鉀離子吸收和轉運方面的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，將所述的煙草AKT1基因轉入到煙草植株中，使AKT1基因超量表達以提高煙草植株的煙葉中鉀離子的含量。