[發(fā)明專利]一種基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610877566.1
• 申請(qǐng)日: 2016-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN106399519B
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭衛(wèi)國(guó);盧文翔;涂慧珍;熊麗娟;朱淼;白云飛;朱毅華;顧萬(wàn)君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京迪康金諾生物技術(shù)有限公司;無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

本發(fā)明公開了一種基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法及其應(yīng)用，包括上下游引物設(shè)計(jì)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成，上游引物擴(kuò)增產(chǎn)物消化、純化，及下游引物富集擴(kuò)增過(guò)程。本發(fā)明僅有上游引物3’端擴(kuò)增的產(chǎn)物能與上游引物5’端形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的區(qū)域被捕獲，因而特異性強(qiáng)；形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列特殊，使得下游引物組可以對(duì)目標(biāo)捕獲區(qū)域進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，因而極少量基因組即可達(dá)到后續(xù)檢測(cè)需要，靈敏度高；用于本方法的引物組可以通過(guò)DNA芯片技術(shù)合成引物池，因而可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)千個(gè)目標(biāo)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)高、低通量的兼容；本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需設(shè)計(jì)目標(biāo)捕獲區(qū)域的上下游引物，避免固相或液相捕獲方法的設(shè)計(jì)大量全區(qū)域捕獲探針的麻煩；檢測(cè)成本低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種目標(biāo)區(qū)域的捕獲方法，尤其涉及一種基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

基于二代測(cè)序的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法為生命科學(xué)研究及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)帶來(lái)了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。與全基因組測(cè)序相比，目標(biāo)區(qū)域的捕獲富集測(cè)序極大的降低了成本，提高了對(duì)目標(biāo)基因檢測(cè)的質(zhì)量，減輕了冗余的數(shù)據(jù)分析過(guò)程。目前已開發(fā)了多種目標(biāo)區(qū)域的捕獲策略，主要有多重PCR捕獲、固相芯片捕獲、液相探針捕獲及分子倒置探針捕獲等。

多重PCR捕獲技術(shù)是應(yīng)用較為廣泛的一種捕獲技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。設(shè)計(jì)思路簡(jiǎn)單，成本低廉，便于操作，靈敏度高。但是，大量引物對(duì)的相互干擾，往往產(chǎn)生大量非特異擴(kuò)增，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)某些捕獲區(qū)域擴(kuò)增失敗的可能。

固相芯片捕獲技術(shù)是將捕獲探針原位合成在DNA芯片上，通過(guò)與構(gòu)建完成的文庫(kù)雜交，洗去非特異雜交文庫(kù)，保留捕獲區(qū)域后進(jìn)行測(cè)序的技術(shù)。通常一個(gè)樣本需要一塊捕獲芯片，捕獲探針長(zhǎng)度為60-90個(gè)堿基，捕獲區(qū)域?yàn)?-5Mb。該方法探針獲得簡(jiǎn)單，捕獲區(qū)域大；但是操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，通量低，靈敏度低，需要大量樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建后再捕獲。

液相探針捕獲技術(shù)是基于固相探針合成方法的改進(jìn)。該方法通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄固相探針產(chǎn)生生物素標(biāo)記的RNA探針，在溶液中進(jìn)行雜交富集，獲得捕獲的目標(biāo)區(qū)域。液相捕獲技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量樣本操作，捕獲特異性高；但是探針制作復(fù)雜，價(jià)格昂貴，RNA探針本身的易降解問(wèn)題對(duì)操作要求高。

分子倒置探針捕獲技術(shù)是基于酶學(xué)方法的改進(jìn)。分子倒置探針由捕獲區(qū)域兩端特異性靶向序列和連接臂構(gòu)成，由一種DNA聚合酶填補(bǔ)2條特異性靶向序列間的間隙從而環(huán)化，獲得目標(biāo)捕獲區(qū)域。該方法無(wú)需將樣本事先機(jī)械打斷構(gòu)建文庫(kù)，特異性高，操作簡(jiǎn)便。但是分子倒置探針的獲得成本昂貴，且設(shè)計(jì)復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容

解決的技術(shù)問(wèn)題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，獲得一種特異性強(qiáng)、靈敏度高，且能夠兼容高、低通量，成本低廉的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法，本發(fā)明提供了一種基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：一種基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法，包括以下步驟：

第1步、向包含目標(biāo)捕獲區(qū)域的基因組試樣中，加入至少一條上游引物，進(jìn)行單向擴(kuò)增反應(yīng)并形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；擴(kuò)增體系中還包括dNTPs、Taq酶和緩沖液；

第2步、將第1步的單向擴(kuò)增產(chǎn)物置于冰上，冷卻；

第3步、采用單鏈DNA外切酶對(duì)第2步的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，并利用磁珠富集法進(jìn)一步純化，收集具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的目標(biāo)捕獲序列；

第4步、向具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的目標(biāo)捕獲序列中加入至少一條下游引物，進(jìn)行富集擴(kuò)增，擴(kuò)增體系中還包括dNTPs、Taq酶和緩沖液。

優(yōu)選的，所述上游引物5’端為目標(biāo)捕獲區(qū)域下游的反向互補(bǔ)序列，用于與單向擴(kuò)增得到的目標(biāo)捕獲區(qū)域下游退火形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；上游引物3’端為目標(biāo)捕獲區(qū)域上游特異性擴(kuò)增序列，用于擴(kuò)增目標(biāo)捕獲區(qū)域；其中，上游引物5’端反向互補(bǔ)區(qū)域的Tm值大于55℃。

優(yōu)選的，所述上游引物5’端反向互補(bǔ)區(qū)域的Tm值為70～80℃，且大于3’端特異性擴(kuò)增序列的Tm值。