[發(fā)明專利]色霉素A2、A3的生物合成及提純工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610874875.3
• 申請日: 2016-10-08
• 公開（公告）號: CN106399349B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設計）人: 占紀勛;于大禹
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州唯鉑萊生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12N15/31;C12P19/56
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種色霉素A2、A3的生物合成及提取純化工藝。

背景技術(shù)

色霉素(Chromomycin)是一種糖基化聚酮化合物，屬于金霉酸家族的成員。色霉素和金霉酸類其它大多數(shù)抗生素一樣，已被研究證實具有良好的抗細菌、抗真菌以及抗癌活性。通過與位于DNA上富含GC的核苷酸序列相互作用，色霉素能夠抑制依賴DNA的RNA聚合酶，并抑制mRNA的合成，從而抑制癌細胞的分裂增殖。特別是對像腦癌、睪丸癌等病毒性腫瘤，色霉素具有顯著的抑制效果。此外，近期研究也發(fā)現(xiàn)，色霉素能夠刺激K562細胞進行紅系分化，在神經(jīng)療法上能夠抑制神經(jīng)細胞凋亡，并具備抗人類免疫缺陷病毒Ⅰ型的抗病毒活性。色霉素原產(chǎn)自灰色鏈霉菌7號，也是目前工業(yè)生產(chǎn)所采用的主要菌種。色霉素A3現(xiàn)已實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，而色霉素A2與A4則是其生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物。產(chǎn)量較低、純度不足是目前色霉素生產(chǎn)的最主要問題，這也導致其售價居高不下。本發(fā)明通過過表達激活基因SrcmRI，同時敲除抑制基因SrcmRII構(gòu)建的工程菌實現(xiàn)色霉素A2、A3的高產(chǎn)，獲得產(chǎn)物的純度相較于傳統(tǒng)生產(chǎn)方式更高，并且能夠顯著降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，提供了一種基于基因工程菌的色霉素A2、A3的高效生物合成及提取工藝。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種色霉素A2、A3的生物合成及提純工藝，包括下述步驟：

(1)SrcmRI基因過表達工程菌SR1的構(gòu)建

以純化的鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI:5’-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3’和引物14-2-SARP-R-XbaI:5’-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3’，通過聚合酶鏈式反應擴增激活基因SrcmRI片段，擴增反應的條件為98℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，30個循環(huán)，利用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和XbaI將上述擴增得到的基因片段連接到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pSET152的XbaI位點，即得本發(fā)明所需的SrcmRI基因過表達質(zhì)粒pZJ183。參照《微生物學實驗》(第4版)介紹的方法，將該pZJ183質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導入鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株，即得本發(fā)明所需的重組工程菌株SR1。

(2)SrcmRII基因敲除工程菌SR2的構(gòu)建

以純化的鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI:5’-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3’、PadRout-left-R-XbaI:5’-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3’和右臂引物PadRout-right-F-XbaI:5’-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3’、PadRout-right-R-HindIII:5’-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3’，通過聚合酶鏈式反應擴增一個包含有無功能ΔSrcmRII基因的2.3kb片段，擴增反應的條件為98℃15秒，60℃15秒，72℃100秒，30個循環(huán)。將上述擴增得到的片段克隆到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139的EcoRI/HindIII位點，即得本發(fā)明所需的SrcmRII基因敲除質(zhì)粒pZJ196。參照《微生物學實驗》(第4版)介紹的方法，通過接合作用將基因敲除質(zhì)粒pZJ196導入到鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株，將包含基因敲除質(zhì)粒pZJ196的鏈霉菌roseiscleroticus菌株在MS固體培養(yǎng)基上28℃下培養(yǎng)20天，再分別挑取單菌落到3mL的TSBY液體培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)5天，然后取50μL培養(yǎng)液涂布到ISP4固體培養(yǎng)基上。在37℃下培養(yǎng)5天，長出的菌株即為本發(fā)明所需的單交換突變株。將上述篩選得到的單交換突變株接種到不含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)3代，然后挑選相同克隆分別接種到含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基與不含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)5天，篩選出不能在含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上生長，但能夠在不含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上生長的菌落，即為本發(fā)明所需的雙交換突變工程菌株SR2。