[發(fā)明專利]色霉素A2、A3的生物合成及提純工藝有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610874875.3 | 申請日： | 2016-10-08 |
| 公開（公告）號： | CN106399349B | 公開（公告）日： | 2017-11-07 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 占紀(jì)勛;于大禹 | 申請（專利權(quán)）人： | 杭州唯鉑萊生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/76 | 分類號： | C12N15/76;C12N15/31;C12P19/56 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 311113 浙江省杭*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 霉素 a2 a3 生物 合成 提純 工藝 | ||
1.一種色霉素A2、A3的生物合成及提純工藝，其特征在于：其包括下述步驟：
1）SrcmRI基因過表達工程菌SR1的構(gòu)建；
2）SrcmRII基因敲除工程菌SR2的構(gòu)建；
3）SrcmRI基因過表達和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的構(gòu)建；
4）將步驟1）-3）構(gòu)建的工程菌在液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵及產(chǎn)物萃取獲得色霉素提取液；
5）將步驟1）-3）構(gòu)建的工程菌在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)及產(chǎn)物萃取獲得色霉素提取液；
6）將步驟4）或步驟5）中的色霉素提取液進行純化和分析獲得最終產(chǎn)物色霉素A2和色霉素A3；
所述步驟1）的具體工程如下：以純化的鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI: 5’-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3’ 和引物14-2-SARP-R-XbaI: 5’-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3’，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增激活基因SrcmRI片段，擴增反應(yīng)的條件為98℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 30秒，30個循環(huán)，利用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和XbaI將上述擴增得到的基因片段連接到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pSET152的XbaI位點，即得所需的SrcmRI基因過表達質(zhì)粒pZJ183，將該pZJ183質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株，即得所需的重組工程菌株SR1；
所述步驟2）的具體工程如下：以純化的鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI: 5’-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3’、PadRout-left-R-XbaI: 5’-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3’和右臂引物PadRout-right-F-XbaI: 5’-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3’、PadRout-right-R-HindIII: 5’-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3’，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增一個包含有無功能?SrcmRII基因的2.3 kb片段，擴增反應(yīng)的條件為98℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 100秒，30個循環(huán)；將上述擴增得到的片段克隆到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139的EcoRI/HindIII位點，即得所需的SrcmRII基因敲除質(zhì)粒pZJ196，通過接合作用將基因敲除質(zhì)粒pZJ196導(dǎo)入到鏈霉菌roseiscleroticus野生型菌株，將包含基因敲除質(zhì)粒pZJ196的鏈霉菌roseiscleroticus菌株在MS固體培養(yǎng)基上28℃下培養(yǎng)20天，再分別挑取單菌落到3 mL的TSBY液體培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)5天，然后取50 μL培養(yǎng)液涂布到ISP4固體培養(yǎng)基上；在37℃下培養(yǎng)5天，長出的菌株即為所需的單交換突變株，將上述篩選得到的單交換突變株接種到不含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)3代，然后挑選相同克隆分別接種到含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基與不含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)5天，篩選出不能在含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上生長，但能夠在不含有安普霉素的TSBY固體培養(yǎng)基上生長的菌落，即為所需的雙交換突變工程菌株SR2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種色霉素A2、A3的生物合成及提純工藝，其特征在于：所述步驟3）的具體工程如下：將步驟1）所得的SrcmRI基因過表達質(zhì)粒pZJ183通過接合作用導(dǎo)入到步驟2）所得的雙交換突變株SR2中，即得所需的同時具有SrcmRI基因過表達和SrcmRII基因敲除的突變工程菌株SR3。
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