[發明專利]一種基于萜類的煙草代謝組學中新鮮煙葉樣品質量的判別方法

有效

• 申請號: 201610868641.8
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN106324145B
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 陳霞;鄭慶霞;周會娜;金立鋒;李鋒;徐國云;張慧;李澤鋒;王燃;魏攀
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 郭中民;許延麗

本發明提供了一種基于萜類的煙草代謝組學中新鮮煙葉樣品質量的判別方法。該方法步驟如下：通過檢測新鮮煙葉中植醇和角鯊烯含量，計算其比值，采用氣相色譜串聯質譜GC?MS對代謝組學研究中的新鮮煙葉樣品中植醇和角鯊烯進行絕對定量分析，為代謝組學合格樣品的選擇提供依據。本發明具有準確可靠，簡單可行的特點，可為煙葉代謝特征分析及相關煙葉代謝組學研究提供借鑒。

技術領域

本發明涉及分析化學領域，具體說是涉及一種判別煙草代謝組學研究所用的新鮮煙葉樣品質量是否滿足代謝組學研究需要的判別方法。

背景技術

植物代謝組學是通過考察植物受刺激或擾動后期代謝產物的變化或其隨時間的變化，來研究植物體的一種技術。在代謝組學輪廓分析的流程中，典型樣品的采集是首要并且極其重要的步驟，獲得合格樣品，以真實客觀的反映樣品的代謝狀態，是代謝組學分析進行的基礎和前提。新鮮煙葉樣品的采集，需要在低溫下淬滅以停止其生理活動以保證其停止在采樣時的代謝狀態，標準做法為采摘植物樣品后，錫紙包裹，置于-196℃液氮冷凍，用于新鮮煙葉樣品分析或者凍干后干粉樣品分析。在樣品采摘到分析前的這一段過程，需保證新鮮煙葉樣品在液氮中保存且在液氮條件下研磨，否則會造成煙葉的酶促褐變。由于煙葉樣品保存不當而導致的質量發生變化，代謝物水平不能反映煙葉樣品真實狀態的情況時有發生。急需一種簡單、快速的分析方法對植物代謝組學研究中的煙葉樣品質量進行判別。

煙葉萜類化合物與煙葉香氣品質密切相關，它們不但是煙葉重要的香氣前提物質，而且它們的降解產物是煙葉最重要的香氣來源之一。同時，萜類代謝是煙葉的重要次生代謝途徑之一，揮發性萜類化合物在植物對環境脅迫的適應、植物與植物之間的相互競爭和協同進化、植物對昆蟲的危害、草食性動物的采食及病原微生物的侵襲等過程的防御中起著重要作用。近年來有關煙葉中萜類化合物的分離、鑒定及檢測取得了一定進展，但未曾有人提出將新鮮煙葉中的萜類化合物含量或含量比值用于代謝組學新鮮煙葉樣品質量的判別。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于萜類的煙草代謝組學中新鮮煙葉樣品質量的判別方法。本發明利用新鮮煙葉中植醇和角鯊烯含量的比值對代謝組學研究中的新鮮煙葉樣品質量進行判別，該法操作簡單快速，結果準確可靠。

本發明的目的是通過下述技術措施來實現：

本發明的基于萜類的煙草代謝組學中新鮮煙葉樣品質量的判別方法通過檢測新鮮煙葉中植醇和角鯊烯含量，計算其比值，采用氣相色譜串聯質譜GC-MS對代謝組學研究中的新鮮煙葉樣品中植醇和角鯊烯進行絕對定量分析；具體制備方法如下：

a、稱取10~25mg的凍干研磨煙葉樣品，加入提取溶劑正己烷0.75~1.5 mL，室溫下超聲提取30min，離心，將上清液轉移到樣品瓶中，并用氮氣吹干；提取后的殘渣加入0.6~1.2 mL由甲醇和氫氧化鉀溶液按4:1的體積比組成的混合液，70℃下振蕩提取30min，離心，將上清液轉移到Eppendorf管中；加入0.5~1.0mL正己烷，進行萃取；渦旋6 s，離心1 min；之后轉移到上述樣品瓶中，并用氮氣吹干；衍生化：加入50~100μL 20mg/mL甲氧胺鹽酸鹽-吡啶溶液，40~60℃反應60~90分鐘，再加入50~100 μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，在40~60℃條件下反應30~90分鐘，進GC/MS分析，采用保留時間和選擇離子（SIM）模式定性，檢測萜類物質的含量；

b、GC/MS分析方法的氣相色譜參數：色譜柱：DB-35MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f. )；程序升溫：起始溫度60℃（3 min），25℃/min的速度升至210℃，0.8℃/min的速度升至220℃，15℃/min的速度升至310℃（13min）。載氣：氦氣；柱流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣量 2 μL，分流進樣，分流比 10:1；