[發明專利]一種從細胞懸液中提取和純化包裹藥物的細胞囊泡的方法

有效

• 申請號: 201610866539.4
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN107875124B
• 公開（公告）日: 2021-08-06
• 發明（設計）人: 張一;李凱
• 申請（專利權）人: 湖北盛齊安生物科技股份有限公司
• 主分類號: A61K9/127
• 分類號: A61K9/127;A61K47/46;A61K31/519;A61K31/704;A61P35/00
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

本發明提供了一種從細胞懸液中提取和純化包裹藥物的細胞囊泡的方法，包括：1)將細胞懸液過濾，收集濾液；2)將步驟1)收集的濾液離心，收集沉淀，獲得包裹藥物的細胞囊泡；其中所述的過濾為將所述細胞懸液通過孔徑為5μm?10μm的濾膜或濾芯過濾；所述的離心為以100?100000g的離心力高速離心；所述的包裹藥物的細胞囊泡為凋亡細胞釋放的含有腫瘤治療藥的微顆粒，所述的細胞懸液為包含所述細胞、細胞碎片和細胞囊泡的混合液。本發明方法的工藝相對簡單，對儀器的損耗較小，沒有污染，細胞囊泡的收率高，有利于實現工業化生產，且由該方法獲得的包裹藥物的細胞囊泡具有更高的含藥量和更好的治療效果。

技術領域

本發明涉及一種從細胞懸液中提取和純化包裹藥物的細胞囊泡的方法。

背景技術

腫瘤是一種嚴重威脅人類生命的頑疾。近年來，其治療方法主要有放療和化療。然而這兩種常規的腫瘤治療方法，在消除腫瘤細胞的同時，也會殺傷正常組織細胞，損害患者的免疫系統，導致其免疫功能缺陷或下降，大大降低了患者的生存質量，給患者帶來難以承受的毒副作用，致使放化療失敗。針對放化療的毒副作用，人們想到用載體包裹化療藥物的方法，使化療藥物選擇性地在腫瘤部位釋放，甚至選擇性地進入腫瘤細胞內，從而達到選擇性殺傷腫瘤細胞的效果。但是外源性載體對生物機體也有一定的毒副作用，同時臨床使用的載體顆粒的粒徑也使其容易穿過正常細胞的細胞膜，從而增加了載體及其所包裹的化療藥物對機體的毒副作用。

為了克服上述放化療腫瘤治療法和采用外源性載體包裹化療藥治療腫瘤的方法的缺陷，中國專利CN102302784A公開了一種腫瘤化療藥物制劑及其制備方法，該制劑是以源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡為載體，用其包裹腫瘤化療藥制備而成。該制劑直接到達腫瘤部位，提高了化療藥的藥效，同時克服了因外源載體給藥而對機體產生的毒副作用。CN102302784A還公開了所述腫瘤化療藥物制劑的制備方法，其中采用梯度離心的方法從經腫瘤化療藥物處理的腫瘤細胞培養液中提取純化含有細胞囊泡和被包裹其中的化療藥的微顆粒(參見CN102302784A說明書實施例1的實驗步驟2(3))。具體地，逐步離心腫瘤細胞培養液，取離心后的上清液再離心，即以500rpm、1000rpm、5000rpm的轉速各離心10分鐘，之后以14000g的離心力離心1分鐘，以除去細胞及碎片，再以14000g的離心力離心1小時，獲得所述微顆粒。

通過梯度離心的方法可選擇性的除去細胞碎片，但同時也會損失掉部分囊泡，從而導致最終收集得到的細胞囊泡的數量減少。并且高速離心時的離心體積較大，會降低梯度離心收集囊泡的效率，使得工業化生產的難度較大，從而不能滿足大規模的臨床用藥。

發明內容

針對梯度離心收集囊泡效率低的問題，本發明的目的在于提供一種從細胞懸液中制備包裹藥物的細胞囊泡的方法。

為實現上述目的，本發明提供了一種從細胞懸液中提取和純化包裹腫瘤治療藥的細胞囊泡的方法，包括下述步驟：

1)將細胞懸液過濾，收集濾液；

2)將步驟1)收集的濾液離心，收集沉淀，獲得包裹藥物的細胞囊泡；

其中步驟1)所述的過濾為將所述細胞懸液通過孔徑為5μm-10μm的濾膜或濾芯過濾；

步驟2)所述的離心為以100-100000g的離心力高速離心；

其中，所述的細胞懸液的制備方法為：

用化學、物理或生物方法使細胞發生凋亡，將凋亡的細胞與腫瘤治療藥接觸，使得所述腫瘤治療藥被包裹進入凋亡的細胞，所述的包裹藥物的細胞囊泡為凋亡細胞釋放的含有腫瘤治療藥的微顆粒，所述的細胞懸液為包含所述細胞、細胞碎片和細胞囊泡的混合液。

本發明所述的細胞懸液為含有細胞囊泡的細胞培養液，其中所述細胞包括但不限于各種腫瘤細胞和紅細胞等。

所述使細胞發生凋亡的方法優選紫外線照射，或者將細胞直接與化療藥物接觸，或者將細胞與放射線接觸的方法。