[發明專利]一種通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法及應用

有效

• 申請號: 201610865232.2
• 申請日: 2016-09-29
• 公開（公告）號: CN106399299B
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 李杉;王菊芳;馬毅;張蓓蕾
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N9/12;C12N15/54;C12Q1/48
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

本發明公開一種通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法及應用，屬于基因工程領域的基因重組表達技術領域。酶的基因來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)。通過基因重組獲得大片段Bst DNA聚合酶質粒。將大片段Bst DNA聚合酶的第310位氨基酸G突變為L或A，或將510位氨基酸D突變為E，突變位點氨基酸均為保守氨基酸。結果顯示與野生型Bst DNA聚合酶相比，突變體G310L、G310A和D540E的聚合效率均有顯著提高，且都高于商業化Bst DNA聚合酶，具有較大的應用價值，為Bst DNA聚合酶國產化提供便利。

技術領域

本發明屬于基因工程領域的基因重組表達技術領域，具體涉及一種通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)活性的方法及應用。

背景技術

核酸擴增技術廣泛應用于醫學研究的各個領域，特別是傳染病病原的檢測，近年來以等溫擴增為代表的新方法因檢測簡單、快速以及高特異性高靈敏性，具有更為廣泛的的應用價值。(Tsugunori Notomi,HarumiMasubuchi,Toshhihiro Yonekawa et al.,“Loop-mediated isothermal amplification of DNA,”Nucleic Acids Research,vol,28,No.12,2000)。

IsothermalMultiple-Self-Matching-InitiatedAmplification(IMSA)等溫擴增是 Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)等溫擴增基礎上發展起來的另一種新型等溫擴增方法，與之相比具有更高的靈敏度，檢測限更低等優點(Xio ng Ding,KaiNie,Lei Shi,Xuejun Ma,“Improved Detection Limit in Rapid Detection of HumanEnterovirus71 and Coxsackievirus A16 by a Novel Revers eTranscription–IsothermalMultiple-Self-Matching-Initiated AmplificationAssay,”J ournal ofClinical Microbiology,vol.52,no.6,pp.1862–1870,2014)，因此本發明所涉及的等溫擴增方法均選擇IMSA。

等溫擴增依賴于Bst DNA聚合酶，其屬于I型DNA聚合酶，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌屬，完整序列包含三種活性(i):5′-3′外切酶活性(ii)5′-3′聚合酶活性(iii)3′-5′外切酶活性，與其他DNA聚合酶相比，Bst DNA聚合酶有著較強的熱穩定性、鏈置換活性及聚合酶活性，因此吸引了越來越多的人的研究興趣 (Seng-Meng Phang,Chai-Yaw Teo,Victor WongThi Wong,et al.,“Cloning and complete sequence of the DNA polymerase-encodinggene(BstpolⅠ)and characterisation of the Kleow-like fragment fromBacillusstearothermophilus,” Gene,vol.163,pp.65-68,1995)。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法。酶的基因來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)GIM1.543(購自中國工業微生物菌種保藏中心)。通過基因重組獲得大片段Bst DNA聚合酶質粒。將大片段Bst DNA聚合酶的第310位氨基酸G突變為L或A，或將510位氨基酸D 突變為E，突變位點氨基酸均為保守氨基酸。結果顯示與野生型Bst DNA聚合酶相比，突變體G310L、G310A和D540E的聚合效率均有顯著提高，且都高于商業化Bst DNA聚合酶，具有較大的應用價值。