[發(fā)明專利]一種L?天冬氨酸氧化酶包涵體純化復(fù)性方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610864870.2
• 申請(qǐng)日: 2016-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN106636024A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒培建;王鵬舉;張文宇;蔣溱;楊錦勛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州埃德蒙生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/06
• 分類號(hào): C12N9/06;C12N15/70
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責(zé)任公司32102
• 代理人: 姚姣陽(yáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復(fù)性方法，屬于生物工程領(lǐng)域的蛋白質(zhì)表達(dá)純化工藝。

背景技術(shù)

在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中，如何獲得生物學(xué)活性的蛋白是一個(gè)關(guān)鍵性問題，這對(duì)于研究基因的功能、開發(fā)蛋白治療藥物以及制備生物材料都具有重要的意義。使用最廣泛的表達(dá)宿主大腸桿菌，蛋白往往以不可溶的包涵體形式出現(xiàn)，如何從無活性的包涵體中復(fù)性獲得具有生物活性的可溶蛋白，成為蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的一大難題。

當(dāng)?shù)鞍自谠怂拗髦写罅勘磉_(dá)時(shí)，由于宿主細(xì)胞內(nèi)折疊因素的限制，比如蛋白表達(dá)過快或者蛋白折疊理化環(huán)境不合適，導(dǎo)致部分蛋白錯(cuò)誤折疊或者未能折疊完成形成不可溶狀態(tài)而形成沉淀的包涵體。包涵體可以在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)空間中聚集，一般為球狀，由于宿主和培養(yǎng)條件的不同，其大小也不相同，一般直徑范圍為0.1-0.8μm，結(jié)構(gòu)致密，能夠抵抗細(xì)胞內(nèi)蛋白酶酶解。海綿狀的包涵體同時(shí)含有活性組分和無活性組分，也具有部分生物學(xué)活性。

L-天冬氨酸氧化酶存在于細(xì)菌，古菌，植物以及動(dòng)物細(xì)胞中，該酶在細(xì)菌內(nèi)是煙酰胺二核苷酸從頭合成途徑的第一個(gè)酶。目前，多種不用來源和功能的L-天冬氨酸氧化酶在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，但是產(chǎn)量較低，大部分蛋白以無活性的包涵體形式存在。但是尚無有效的方法進(jìn)行包涵體的復(fù)性，嚴(yán)重制約該類酶在工業(yè)上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決上述的技術(shù)問題，提供一種有效的L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復(fù)性方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復(fù)性方法，包括如下步驟：

S1、包涵體沉淀的收集，將L-天冬氨酸氧化酶基因進(jìn)行針對(duì)大腸桿菌密碼子優(yōu)化，通過全基因合成構(gòu)建于大腸桿菌表達(dá)載體上，通過誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)菌體；將表達(dá)菌體使用6000rpm離心15分鐘收集菌體，使用緩沖液A洗滌并懸起，菌體高壓破碎，離心收集包涵體沉淀獲得包涵體沉淀；

S2、包涵體沉淀的充分洗滌，對(duì)S1中的包涵體沉淀使用含有非離子型表面活性劑的緩沖液B漂洗兩次，再使用不含有非離子型表面活性劑的緩沖液C漂洗兩次，并使用含有6~8M變性劑的緩沖液C溶解蛋白；

S3、變性蛋白使用鎳柱純化，首先使用緩沖液C洗脫非特異性結(jié)合的雜蛋白，最終使用緩沖液D洗脫目的蛋白；

S4、將純化的變性蛋白使用緩沖液D稀釋至蛋白濃度低于1mg/ml，置于透析緩沖液中保持透析溫度為4℃，透析12小時(shí)以上，離心收集上清。

S5、將上清使用超濾管濃縮，加入FAD，在溫度4℃時(shí)，結(jié)合30分鐘以上，再通過分子篩純化分離單體蛋白和聚集蛋白，獲得均一的天然活性蛋白，所述目的蛋白摩爾量與FAD摩爾量之比小于1：3。

優(yōu)選地，所述緩沖液A為，50 mMTris-HCl，100 mMNaCl，pH 8.0；

所述緩沖液B為，50 mMTris-HCl，100 mMNaCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM DTT，1% TritonX-100，pH 8.0；

所述緩沖液C為，50 mMTris-HCl，200 mMNaCl，10~30 mM imidazole，8 M urea，pH 8.0；

所述緩沖液 D為，50 mMTris-HCl，200 mMNaCl，300~500 mM imidazole，8 M urea，pH 8.0；

所述透析緩沖液為20mM Na₂HPO₄，200mMNaCl，pH 8.0。

優(yōu)選地，所述S2中使用的非離子型表面活性劑為TritonX-100，所述菌體與緩沖液重量體積比為1：50。

優(yōu)選地，所述S2中所述非離子型表面活性劑濃度為0.5%-1%。

優(yōu)選地，所述S2中變性劑為尿素。

優(yōu)選地，所述S3中也可以將S2漂洗后的蛋白直接使用含有300~500mM咪唑的緩沖液直接溶解蛋白，所述緩沖液為，50 mMTris-HCl，100 mMNaCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM DTT，pH 8.0。

優(yōu)選地，所述L-天冬氨酸氧化酶序列為SEQ ID NO.1。

優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為PET載體，所述工程菌誘導(dǎo)表達(dá)溫度為30~37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4~6小時(shí)。