[發明專利]一種L?天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法

在審

• 申請號: 201610864870.2
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN106636024A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 鄒培建;王鵬舉;張文宇;蔣溱;楊錦勛
• 申請（專利權）人: 蘇州埃德蒙生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/70
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司32102
• 代理人: 姚姣陽

1.一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、包涵體沉淀的收集，將L-天冬氨酸氧化酶基因進行針對大腸桿菌密碼子優化，通過全基因合成構建于大腸桿菌表達載體上，通過誘導表達，獲得表達菌體；將表達菌體使用6000rpm離心15分鐘收集菌體，使用緩沖液A洗滌并懸起，菌體高壓破碎，離心收集包涵體沉淀獲得包涵體沉淀；

S2、包涵體沉淀的充分洗滌，對S1中的包涵體沉淀使用含有非離子型表面活性劑的緩沖液B漂洗兩次，再使用不含有非離子型表面活性劑的緩沖液C漂洗兩次，并使用含有6~8M變性劑的緩沖液C溶解蛋白；

S3、變性蛋白使用鎳柱純化，首先使用緩沖液C洗脫非特異性結合的雜蛋白，最終使用緩沖液D洗脫目的蛋白；

S4、將純化的變性蛋白使用緩沖液D稀釋至蛋白濃度低于1mg/ml，置于透析緩沖液中保持透析溫度為4℃，透析12小時以上，離心收集上清。

2.S5、將上清使用超濾管濃縮，加入FAD，在溫度4℃時，結合30分鐘以上，再通過分子篩純化分離單體蛋白和聚集蛋白，獲得均一的天然活性蛋白，所述目的蛋白摩爾量與FAD摩爾量之比小于1：3。

3.如權利要求1所述的一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：所述緩沖液A為，50 mMTris-HCl，100 mMNaCl，pH 8.0；

所述緩沖液B為，50 mMTris-HCl，100 mMNaCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM DTT，1% TritonX-100，pH 8.0；

所述緩沖液C為，50 mMTris-HCl，200 mMNaCl，10~30 mM imidazole，8 M urea，pH 8.0；

所述緩沖液 D為，50 mMTris-HCl，200 mMNaCl，300~500 mM imidazole，8 M urea，pH 8.0；

所述透析緩沖液為20mM Na₂HPO₄，200mMNaCl，pH 8.0。

4.如權利要求1所述的一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：所述S2中使用的非離子型表面活性劑為TritonX-100，所述菌體與緩沖液重量體積比為1：50。

5.如權利要求1所述的一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：所述S2中所述非離子型表面活性劑濃度為0.5%-1%。

6.如權利要求1所述的一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：所述S2中變性劑為尿素。

7.如權利要求1所述的一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：所述S3中也可以將S2漂洗后的蛋白直接使用含有300~500mM咪唑的緩沖液直接溶解蛋白，所述緩沖液為，50 mMTris-HCl，100 mMNaCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM DTT，pH 8.0。

8.如權利要求1所述的一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：所述L-天冬氨酸氧化酶序列為SEQ ID NO.1。

9.如權利要求1所述的一種L-天冬氨酸氧化酶包涵體純化復性方法，其特征在于：所述表達載體為PET載體，所述工程菌誘導表達溫度為30~37℃，誘導時間為4~6小時。