[發(fā)明專利]用于檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610864283.3
• 申請日: 2016-09-29
• 公開（公告）號: CN106405094B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳立國;鄒偉權(quán);張亞麗;李慶祥;母潤紅;王濤;蘇焱
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州華弘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/574;G01N33/573
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司44416
• 代理人: 張帥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

據(jù)報道，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。降低惡性腫瘤死亡率的主要途徑是早期診斷和早期治療。目前，腫瘤診斷主要依賴影像學(xué)檢查，細(xì)胞學(xué)、生化學(xué)和免疫學(xué)檢驗。后者為主要檢查血清腫瘤標(biāo)志物(tumor marker，TM)，由于TM的敏感性和特異性相對較高，較為經(jīng)濟(jì)，檢查時痛苦少，且適合大批量標(biāo)本檢測，TM的臨床應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。

丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途徑的一個關(guān)鍵酶，它有四種同工酶，分別為L型、R型、Ml型和M2型，它們的分布具有相對的組織特異性，通常均以酶的活性四聚體形式存在。目前研究表明，幾乎所有不同組織來源的腫瘤均伴有丙酮酸激酶的異構(gòu)重整體M2-PK的過度表達(dá),故稱為腫瘤型M2-PK(Tumor M2-PK，TU M2-PK)。在正常細(xì)胞中，M2-PK主要以三聚體的形式存在，而在腫瘤細(xì)胞中，M2-PK大量表達(dá)并轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕远垠w的形式存在。三聚體的M2-PK與磷酸烯醇丙酮酸pep親和力很高，而二聚體的M2-PK與pep的親和力則低的多，后者因此導(dǎo)致磷酸烯醇類物質(zhì)的堆積，這有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)行無氧糖酵解。TU M2-PK的升高可見于大多數(shù)癌癥患者。盡管不同組織來源的腫瘤或同種腫瘤的不同階段，其血中M2-PK的平均水平存在著一定的差別，但作為腫瘤標(biāo)志物，M2-PK是很有應(yīng)用價值的。尤其是腎癌，長期以來一直未發(fā)現(xiàn)較特異的腫瘤標(biāo)志物,M2-PK很可能成為目前唯一可用于臨床診斷腎癌的生化指標(biāo)。早在1993年，在hamburg召開的(德國)第七界腫瘤標(biāo)志物研討會上，TU M2-PK就作為一種新的腫瘤標(biāo)志物被提了出來。因此，監(jiān)測血液中腫瘤M2型丙酮酸激酶(TU M2-PK)可廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期診斷、腫瘤預(yù)后判斷以及評價腫瘤治療療效等方面。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種腫瘤型M2丙酮酸激酶(TU M2-PK)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有TU M2-PK磁分離試劑，酶標(biāo)記的TU M2-PK抗體溶液，標(biāo)準(zhǔn)品，洗滌液以及化學(xué)發(fā)光底物溶液。.

所述TU M2-PK磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯(lián)有抗TU M2-PK單克隆抗體的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.1mg/ml的吐溫20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。

所述酶標(biāo)記的TU M2-PK抗體溶液是含有1mg/ml辣根過氧化酶標(biāo)記的抗TU M2-PK單克隆抗體和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。

所述的標(biāo)準(zhǔn)品為不同濃度的TU M2-PK標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其分別含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TU M2-PK標(biāo)準(zhǔn)品的50mmol/l PBS緩沖液，pH7.4。

洗滌液由在濃度為20mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入1％的Tween-20配制而成。

所述化學(xué)發(fā)光底物溶液分為發(fā)光底物A溶液和發(fā)光底物B溶液；發(fā)光底物A為0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為5.0mg/mL的魯米諾，所述發(fā)光底物B為是pH值為4.5的0.1M檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100mg/mL的過氧化氫和15mg/mL辣根過氧化氫酶。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述試劑盒的制備方法，具體步驟如下：

1)TU M2-PK磁分離試劑的制備：采用化學(xué)交聯(lián)法將TU M2-PK單克隆抗體和磁性微球偶聯(lián)，磁性微球直徑在1.0μm左右，制備后用PBS緩沖液沖洗三次，然后用70mmol/L的PBS緩沖液重新懸浮，加入終濃度0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨、0.1mg/ml的吐溫20和0.1mg/ml的PEG200，調(diào)pH值至8.0即得；

2)酶標(biāo)記的TU M2-PK抗體溶液的制備：采用NaIO₄法標(biāo)記TU M2-PK單克隆抗體，反應(yīng)后透析純化，然后用20mmol/L的PBS緩沖液溶解，加入終濃度0.5mg/ml酪蛋白，調(diào)pH值至8.0即得；

3)常規(guī)方法配置標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌液和化學(xué)底物溶液。