[發明專利]一種針對RANKL靶向治療藥物的生物學活性檢測方法

在審

• 申請號: 201610859356.X
• 申請日: 2016-09-28
• 公開（公告）號: CN107870232A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 劉培培;劉偉旭;譚青喬
• 申請（專利權）人: 三生國健藥業（上海）股份有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種針對RANKL靶向治療藥物的生物學活性檢測方法。

背景技術

細胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)是細胞核因子κB受體活化因子(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B，RANK)的配體(屬于TNF受體超家族成員)和具有胞內結構域的Ⅱ型跨膜蛋白，是目前發現的惟一具有誘導破骨細胞分化、發育、發揮功能的因子。成骨細胞及骨髓基質細胞表達RANKL，與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結合后，促進破骨細胞的分化及骨吸收活性。RANKL可促進破骨細胞分化，增強成熟破骨細胞的活力，阻止破骨細胞凋亡。近年來通過許多對RANKL的研究發現，它不僅在骨質疏松癥的發病中起重要作用，而且也在骨代謝過程中受多種因素影響，并為骨質疏松癥及其他骨骼疾病的治療開辟了廣闊的前景。

在藥物的研制過程中，生物學活性檢測方法是藥物篩選以及質量控制的重要評價指標，該方法必須通過方法驗證，滿足專屬性、精密度、準確度等方法驗證方面的要求，這樣才能保證生物學活性檢測結果的可靠性，才能用于指導藥物的篩選以及質量控制，因此建立切實可靠的生物學活性檢測方法，對于RANKL靶向治療藥物的研究開發、質量控制乃至臨床應用都具有重要的意義。

目前常用的針對RANKL靶向治療藥物的生物學活性測定方法，是依據RANKL能夠刺激細胞分化成破骨細胞，而藥物可以中和RANKL活性，通過抗酒石酸酸性磷酸酶檢測體系(Tartrate Resistant Acid Phosphatase Assay，TRAP)檢測破骨細胞活性的原理進行實驗設計的。

使用的細胞系主要是RAW264.7細胞，從文獻報道來看，該生物學活性方法并未得到公認或標準化，細胞刺激過程各不相同，如RAW264.7細胞在RANKL刺激過程中，有的文獻報道中還需要增加M-CSF進行協調刺激，實驗重復性與準確性難以得到保障。另外，顯色的方法與顯色條件也各不相同，從文獻報道來看，同樣采用TRAP顯色方法，有的需要借助顯微鏡進行，觀察破骨細胞數量，該方式只能作為一種定性而不能準確定量。更重要的是，在已經報道的針對RANKL靶向治療藥物的生物學活性檢測方法中，缺乏對檢測體系專屬性、精密度、準確度、線性和范圍等方面的方法驗證與評價，難以確保檢測結果的準確性與可靠性。

因此，目前所急需一種能夠簡便、準確、高效地評價RANKL靶向治療藥物的生物學活性檢測方法。

發明內容

本發明的發明人針對現有RANKL靶向治療藥物的生物學活性檢測方法存在的問題與不足，研究了一種能夠簡便、準確、高效地評價RANKL靶向治療藥物的生物學活性檢測方法，該方法能夠滿足方法驗證過程中對專屬性、準確度、精密度(包括重復性、日間差、人員操作誤差)、線性和范圍等方面的要求，對于RANKL靶向治療藥物的研究開發，質量控制乃至臨床應用都具有重要的意義。

為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一為：一種針對RANKL靶向治療藥物的生物活性檢測方法，其包括下列步驟：

(1)細胞鋪板：取對數生長期的檢定用細胞制成細胞懸液，分別加入細胞培養板孔中，然后進行細胞培養，使細胞貼壁；

(2)RANKL稀釋：將RANKL按照標示濃度進行稀釋，得到稀釋液；

(3)參考品及供試品稀釋：取參考品及供試品，根據標示濃度，先預稀釋至一定濃度，再進行梯度稀釋，得到稀釋液；

(4)加樣：將步驟(2)、(3)所得稀釋液依次加入步驟(1)中的細胞培養板孔中，然后進行細胞培養；

(5)顯色：取步驟(4)培養所得細胞，裂解后采用抗酒石酸酸性磷酸酶檢測體系對細胞培養板進行顯色反應；

(6)測定分析：步驟(5)顯色反應完成后，加入NaOH終止液，終止反應，將細胞板內溶液混勻，放入酶標儀，測定顯色反應結果，并根據測定結果計算供試品的生物學活性。

步驟(1)為細胞鋪板：取對數生長期的檢定用細胞制成細胞懸液，分別加入細胞培養板孔中，然后進行細胞培養，使細胞貼壁。

其中所述檢定用細胞為本領域常規細胞株，較佳地為表達細胞核因子κB受體活化因子(RANK)的細胞株，更佳地為小鼠巨噬細胞RAW264.7。