[發(fā)明專利]一種針對RANKL靶向治療藥物的生物學(xué)活性檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610859356.X
• 申請日: 2016-09-28
• 公開（公告）號: CN107870232A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉培培;劉偉旭;譚青喬
• 申請（專利權(quán)）人: 三生國健藥業(yè)（上海）股份有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種針對RANKL靶向治療藥物的生物活性檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

(1)細(xì)胞鋪板：取對數(shù)生長期的檢定用細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁；

(2)RANKL稀釋：將RANKL按照標(biāo)示濃度進(jìn)行稀釋，得到稀釋液；

(3)參考品及供試品稀釋：取參考品及供試品，根據(jù)標(biāo)示濃度，先預(yù)稀釋至一定濃度，再進(jìn)行梯度稀釋，得到稀釋液；

(4)加樣：將步驟(2)、(3)所得稀釋液依次加入步驟(1)中的細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

(5)顯色：取步驟(4)培養(yǎng)所得細(xì)胞，裂解后采用抗酒石酸酸性磷酸酶檢測體系對細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行顯色反應(yīng)；

(6)測定分析：步驟(5)顯色反應(yīng)完成后，加入NaOH終止液，終止反應(yīng)，將細(xì)胞板內(nèi)溶液混勻，放入酶標(biāo)儀，測定顯色反應(yīng)結(jié)果，并根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算供試品的生物學(xué)活性。

2.如權(quán)利要求1所述的生物活性檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述的檢定用細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，所述細(xì)胞懸液的濃度為2×10⁴/mL～5×10⁴/mL，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3～5天。

3.如權(quán)利要求1所述的生物活性檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述的標(biāo)示濃度為50～800ng/mL。

4.如權(quán)利要求1所述的生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的標(biāo)示濃度為500～6000ng/mL，所述的梯度稀釋為1.2～3倍梯度稀釋，所得稀釋梯度為7～11個(gè)。

5.如權(quán)利要求1所述的生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述加樣是將步驟(2)、(3)所得溶液以50μL/孔依次加入步驟(1)所述的細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37℃，5％二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)3～5天。

6.如權(quán)利要求1所述的生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，步驟(5)所述顯色體系為抗酒石酸酸性磷酸酶檢測體系，該檢測體系包含：磷酸對硝基苯酯、酒石酸、檸檬酸鈉等。

7.如權(quán)利要求6所述的生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，所述抗酒石酸酸性磷酸酶檢測體系的加入量為30～60μL/孔。

8.如權(quán)利要求1所述的生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，步驟(6)所述NaOH終止液為1mol/L NaOH；NaOH終止液的加入量為50μL/孔。

9.如權(quán)利要求1所述的生物活性檢測方法，其特征在于，步驟(6)所述供試品生物學(xué)活性通過以下方法獲得，用參考品孔和供試品孔測定值與加樣濃度的量效關(guān)系進(jìn)行4參數(shù)擬合，確定參考品與供試品的EC₅₀值，曲線擬合常數(shù)R²，并按照下列公式計(jì)算供試品的細(xì)胞增殖抑制生物學(xué)活性：

10.如權(quán)利要求1所述的生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，所述RANKL靶向治療藥物包含：單克隆抗體、融合蛋白、激酶抑制劑、反義寡核甘酸、化合物、中藥提取物或中藥復(fù)方提取物之一或它們的任意組合。