[發明專利]一種檢測哺乳動物血液中微量循環腫瘤細胞的特異性方法

有效

• 申請號: 201610858045.1
• 申請日: 2016-09-28
• 公開（公告）號: CN106636329B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發明（設計）人: 賈力;董海燕;王杰;韓龍宇
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/91
• 代理公司: 35100 福州元創專利商標代理有限公司
• 代理人: 蔡學俊

本發明公開了一種檢測哺乳動物血液中微量循環腫瘤細胞的特異性方法，依本方法設計的DNA納米器件（PDN）可特異性的與循環腫瘤細胞表面高表達的蛋白特異性結合，并利用免疫磁珠分離技術將結合有PDN的循環腫瘤細胞從血液中分離。PDN可在酶和引物的作用下進行滾環擴增，其擴增產物能夠與分子信標相結合實現熒光的釋放和檢測。熒光強度與PDN的數量直接相關，從而達到超靈敏檢測血液中微量循環腫瘤細胞的目的。本發明的檢測方法，不僅使檢測變得超靈敏、更具特異性，且無需PCR儀等較昂貴的儀器，有效降低了檢測成本，提高了檢測效率，具有很高的臨床應用價值。

技術領域

本發明涉及一種檢測哺乳動物血液中微量循環腫瘤細胞（CirculatingTumorCell，CTC）的特異性方法。

背景技術

一般人們所說的“癌癥”習慣上泛指所有惡性腫瘤，而腫瘤轉移是腫瘤研究工作的困境之一，超過90%的癌癥患者死于腫瘤轉移。轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，也是臨床絕大多數腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤細胞入侵到原發腫瘤細胞的周圍組織中，進入血液和淋巴管系統，形成循環腫瘤細胞CTC，并轉運到遠端組織，再滲出，適應新的微環境，最終“播種”、“增殖”、“定植”、形成轉移灶。因此早期發現血液中的CTC，對于患者預后判斷、療效評價和個體化治療都有著重要的指導作用。

目前，新興的CTC檢測技術，已成為研究熱點并進入臨床應用。已經建立的CTC檢測方法包括：聚合酶鏈反應和流式細胞術（Cell search系統）。但是，儀器的高成本、費力且耗時較長仍然嚴重制約著CTC作為腫瘤早期診斷的指標在臨床中的應用。因此，有必要提供一種低成本、操作簡單、靈敏度高及特異性強的檢測微量CTC的方法。

近年來，核酸適配體引起了很大的關注。核酸適配體是一小段經體外篩選得到的寡核苷酸序列（RNA和ssDNA），具有特殊的三級結構，能與相應的配體進行強特異性和高親和力的結合。作為一種新型的功能分子探針，核酸適配體因具有易合成及修飾、強穩定性、低成本等特點，而被認為是抗體的理想替代品?？梢姡m配體技術及其在生物醫學的領域有著廣泛的應用，可用于特異性識別靶細胞（尤其是癌癥細胞），用于診斷治療及生物傳感等。

基于適配體可特異性地識別癌癥細胞的特點，同時結合免疫磁珠分離技術對血液中的循環腫瘤細胞進行分離。免疫磁珠分離技術是一種特異性強、靈敏度高及純化性好的的免疫學檢測方法和抗原純化手段。目前，該項技術在細胞分離、蛋白、免疫學及微生物學檢測等方面均取得了較大的進展，是最有推廣價值的技術之一。其中，免疫磁珠分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。

滾環擴增（Rolling Circle Amplification，RCA）是一種高效的恒溫核酸擴增手段，且可在短時間內實現DNA或RNA的指數擴增，通過結合生物標記等，有效地放大信號，極大地增強了檢測靈敏度。近幾年，RCA在功能性核酸的制備、生物傳感及納米材料等領域有著越來越廣泛的應用。同時，RCA技術的發展得益于其自身高靈敏度和高特異性的特點，并且可以與其它高新技術（如表面修飾技術、熒光檢測技術及納米技術等）相結合，開辟更好的應用前景。

本發明方法將適配體特異性識別結合相應配體的特點、免疫磁珠的捕獲技術及RCA技術相結合用于微量CTC檢測，具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短、成本低的特點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測哺乳動物血液中微量CTC的特異性方法。

本發明所采取的技術方案是：

（1）微量循環腫瘤細胞表面高表達蛋白高特異性結合適配體AP的設計與合成：以待測血樣外周血CTC表面高表達的蛋白為模板，基于Cell-SELEX技術，設計可與該蛋白高特異性結合的適配體AP；