[發明專利]三色堇種子浸泡法直接導入外源基因的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201610856551.7
• 申請日: 2016-09-26
• 公開（公告）號: CN106811482B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 胡惠蓉;聶維;楊迪;汪偉;劉思禹;殷超群;岳遠征;包滿珠
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

本發明屬于三色堇分子育種領域，涉及三色堇種子浸泡法直接導入外源基因的遺傳轉化方法。采用已露白的三色堇種子為轉化受體，經根癌農桿菌浸泡介導目的基因導入受體，利用卡那霉素對轉化后的植株進行抗性篩選，通過載體上的啟動子和目的基因設計特異引物進行PCR檢測，同時通過表型觀測篩選得到轉基因植株。本發明解決了三色堇再生頑拗的局限性，避免了常規轉化基于再生體系的組織培養等程序，直接通過種子浸泡法轉化外源基因，為定向改良三色堇的性狀提供了新方法；本發明轉化三色堇的方法不經過再生培養階段，簡化了操作，降低了成本；轉化周期短，露白種子浸泡后長出子葉即可移栽上盆，轉化僅需15天左右。

技術領域

本發明屬于三色堇分子育種技術領域，具體涉及三色堇種子浸泡法直接導入外源基因的遺傳轉化方法。

背景技術

三色堇(Viola×wittrockiana)，屬于堇菜科(Violaceae)堇菜屬(Viola)。其花型可愛多變，花色艷麗，品種豐富，花期較長，具有“花壇皇后”的美譽，是冬春花壇、花境、盆花及圖案等的首選材料之一；同時，由于其耐寒性較強，可以通過調節播種期來調控三色堇的盛花期，使其在元旦前后開花，因此，有廣泛的應用價值。

自1983年第一例轉基因植物問世以來，轉基因植物研究已在培育抗病植物、抗蟲植物、提高作物品質及產量、提高作物抗逆性等方面發揮了巨大的作用。然而目前由于受植物轉基因方法、受體材料等的限制，利用轉基因技術進行植物品質改良受到了一定限制，尤其是對三色堇。近年來，三色堇性狀的改良及新品種的繁育都依靠傳統的雜交育種(王健和包滿珠2007；杜曉華等2010；李清斌等2014；楊迪等2015)，無法通過轉基因的手段進行改良，因其再生研究歷經多年的努力，仍未獲得突破性進展，尚無成熟的再生體系。前人以三色堇的根、下胚軸和子葉片段分別作為外植體誘導出愈傷組織，但由子葉片段得到的愈傷逐漸轉變成綠色玻璃化結構，不能繼續生長，最后枯萎；根和下胚軸誘導出的愈傷無法得到不定芽(Babber and Kulbhushan 1991)。盧興霞(2006)以三色堇花藥作為外植體誘導出愈傷，但是愈傷組織極易生根，無法誘導出芽。劉霞(2007)用六種不同的三色堇器官作為外植體誘導再生，只有頂芽較易存活和增殖。有報道以三色堇的葉柄為外植體初步建立了再生體系：方法是通過葉柄首先誘導出愈傷，依次在兩種繼代培養基上進行培養，然后在分化培養基上誘導分化不定芽，分化出的不定芽在增殖培養基上壯芽和擴增，最后誘導生根(Wangand Bao 2007)。但這一方案步驟復雜，費時費力，難以重復。張其生(2009)初步建立了三色堇的快繁體系，并在Wang的基礎上研究建立了以三色堇無菌苗節間莖段和葉柄為外植體的再生體系，也嘗試過葉片，但沒有成功。由于三色堇的節間莖段和葉柄增殖困難，且易產生玻璃化苗，仍然難以應用。李春燕(2011)在前人的基礎上試圖解決三色堇再生過程中增殖困難和玻璃化問題，通過改良培養基后再生率有所提高，但三色堇的增值材料玻璃化更為嚴重，需多次繼代去除玻璃化，但多次繼代極大影響了無菌苗的再生能力，所以解決問題效果不理想。另外李春燕還嘗試用葉片、葉柄和節間莖段為外植體誘導愈傷組織，但無法誘導出綠色愈傷組織，轉化效果不理想。至此，三色堇這種再生頑拗種的高效再生體系仍然無法建立。

至今三色堇無論采用什么材料，無論基于直接還是間接再生的遺傳轉化，都沒有轉化成功的案例，所以沒有成功建立三色堇遺傳轉化體系的報道。

此外，到目前為止尚未檢索到有關三色堇轉基因的方法的報道，特別是沒有檢索到有關利用三色堇種子浸泡法直接導入外源基因轉化三色堇獲得新植物的方法的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種三色堇種子浸泡法直接導入外源基因的遺傳轉化方法。

本發明是這樣實現的：