[發明專利]三色堇種子浸泡法直接導入外源基因的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201610856551.7
• 申請日: 2016-09-26
• 公開（公告）號: CN106811482B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 胡惠蓉;聶維;楊迪;汪偉;劉思禹;殷超群;岳遠征;包滿珠
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種三色堇種子浸泡法直接導入外源基因的遺傳轉化方法，其特征在于，采用已露白的三色堇種子作為轉化的受體材料，經根癌農桿菌浸泡介導目的基因導入受體，利用卡那霉素作為選擇劑對轉化后的植株進行篩選，通過PCR檢測及表型觀測篩選得到轉基因植株，所述的轉化步驟如下所述：

(1)構建含有目的基因的重組質粒并導入根癌農桿菌，其中：重組質粒含NPTⅡ基因，具備卡那霉素抗性，且目的基因由35S啟動子驅動；

(2)將三色堇種子，裝入離心管，加入蒸餾水，將種子振蕩至管底，將離心管于40℃水浴15min后自然冷卻，黑暗下靜置23h后棄管內蒸餾水，加入80mg/L赤霉素溶液，振蕩后在黑暗下靜置1h，將種子置于雙層紗布中，用蒸餾水沖洗搓去種子表面膠質，將種子用雙層無菌紗布包裹，置于10％雙氧水中振蕩消毒15min，用蒸餾水洗凈后將種子平鋪于墊有濕潤雙層紗布的培養皿中，室溫下暗培養，每隔24h觀察種子狀態，添加適量蒸餾水保持濕潤，得到露白的胚根長為2～4mm的三色堇種子；

(3)將步驟(2)所得的三色堇種子，置于步驟(1)所得的OD₆₀₀為0.4，卡那霉素濃度為100mg/L的根癌農桿菌菌液中浸泡1.5h進行侵染；將侵染過的種子用蒸餾水清洗4-5次后放入培養皿中，在27±1℃黑暗條件下繼續培養；

(4)將步驟(3)中的黑暗培養的種子于子葉脫離種皮后置于光照強度為2000lx光下培養，至子葉變綠時移栽入花盆中，于4-5片真葉后進行抗性篩選；

(5)對步驟(4)中的幼苗噴施350mg/L的卡那霉素溶液進行抗性篩選，獲得抗性苗；

(6)通過載體上的35S啟動子和目的基因設計特異引物，對步驟(5)中的抗性苗進行PCR檢測，獲得陽性植株；

(7)對步驟(6)中的陽性植株進行表型觀測，與野生型三色堇植株進行比較，獲得表型發生明顯改變的轉基因植株。