[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610855072.3
• 申請(qǐng)日: 2016-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN106282377B
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉二龍;呂英姿;盧麗;許龍巖;蔣湘;李立霞;李嘉琪;杜雅萍;林學(xué)勤;鄭高彬;樊武疆;林先準(zhǔn);李培深;蘇彩珠;唐涌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明針對(duì)轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性序列(美洲綿鳚抗凍蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域與鮭魚基因組5’端鄰接區(qū)序列)設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立轉(zhuǎn)基因鮭魚實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)方法，利用該檢測(cè)引物和檢測(cè)探針，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)靈敏度為60拷貝，檢測(cè)重復(fù)性良好，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage的鑒定，滿足監(jiān)管部門對(duì)其轉(zhuǎn)基因鮭魚正確標(biāo)識(shí)的需求。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

美國食品藥品管理局(U.S.food and Drug Administration,FDA)2015年11月16日發(fā)布公告確定水優(yōu)鮭魚(三文魚)(商品名AquAdvantage Salmon,AAS)與非轉(zhuǎn)基因鮭魚一樣安全，這標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因鮭魚獲得美國權(quán)威機(jī)構(gòu)的最終批準(zhǔn)，依法可以商業(yè)銷售及食用。

轉(zhuǎn)基因鮭魚由加拿大水豐(AquaBounty)公司研發(fā)，自1995年水豐公司致函美國FDA申請(qǐng)調(diào)查開始，到獲得批準(zhǔn)所花時(shí)間約二十年。AAS經(jīng)由顯微注射構(gòu)建的opAFP-GHc2(the regulatory sequences of an antifreeze protein(AFP)gene,opAFP,；theprotein coding domain of a growth hormone gene,GHc2)到野生鮭魚魚卵研發(fā)而成，所使用的轉(zhuǎn)基因元件來自大鱗大馬哈魚(王鮭)的生長激素蛋白編碼區(qū)和美洲綿鳚抗凍蛋白基因調(diào)控序列。重組后的生長激素基因可讓鮭魚的寒冷環(huán)境下仍然保持生長，使轉(zhuǎn)基因鮭魚達(dá)到上市規(guī)格的生長周期由3年縮短至18個(gè)月，大大降低了鮭魚的養(yǎng)殖成本。

轉(zhuǎn)基因鮭魚直接食用的安全性和生態(tài)安全性是人們普遍擔(dān)心問題。轉(zhuǎn)基因鮭魚可能與自然環(huán)境中的其他魚種發(fā)生有性交配，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因漂移到自然魚中，影響物種遺傳多樣性，或產(chǎn)生其他的未知風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品多數(shù)國家均采用相應(yīng)的標(biāo)識(shí)管理制度，標(biāo)識(shí)管理制度的建立和實(shí)施依賴于有效準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定技術(shù)。品系特異性PCR(轉(zhuǎn)化事件特異性)(Event-specific PCR)檢測(cè)的目標(biāo)序列是外源插入序列與植物基因組間連接區(qū)，相較于篩選PCR(Screening PCR)、基因特異性PCR(Gene-specific PCR)、構(gòu)建特異性PCR(Construct-specific PCR)具有更加高的具有高有特異性，能用于檢測(cè)鑒定轉(zhuǎn)基因具體品系，是目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)研究和實(shí)際檢測(cè)工作中的重要方法。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，快速準(zhǔn)確鑒別轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性檢測(cè)引物。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)引物如下所示：

Aqu-F：5‘-CACGTTGTACTGCTGATA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Aqu-R：5‘-GTGGTTTAGTTCTCATACATC-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本發(fā)明還提供了相配套的檢測(cè)探針，所述的檢測(cè)探針為：5‘-CCTCACGTTGTACTACTGATACCACA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶、檢測(cè)引物和檢測(cè)探針，其特征在于，所述的檢測(cè)引物如下所示：