[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測引物、檢測方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610855072.3
• 申請日: 2016-09-27
• 公開（公告）號: CN106282377B
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉二龍;呂英姿;盧麗;許龍巖;蔣湘;李立霞;李嘉琪;杜雅萍;林學(xué)勤;鄭高彬;樊武疆;林先準(zhǔn);李培深;蘇彩珠;唐涌
• 申請（專利權(quán)）人: 黃埔出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測引物和檢測探針的組合，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

Aqu-F：5‘-CACGTTGTACTGCTGATA-3’；

Aqu-R：5‘-GTGGTTTAGTTCTCATACATC-3’，

所述的檢測探針為：5‘-CCTCACGTTGTACTACTGATACCACA-3’，5’端標(biāo)記有熒光報告基團，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測引物和檢測探針的組合，其特征在于，所述的熒光報告基團為FAM，所述的熒光淬滅基團為BHQ1。

3.一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光定量PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

Aqu-F：5‘-CACGTTGTACTGCTGATA-3’；

Aqu-R：5‘-GTGGTTTAGTTCTCATACATC-3’；

所述的檢測探針如下所示：

5‘-CCTCACGTTGTACTACTGATACCACA-3’，5’端標(biāo)記有熒光報告基團，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團。

4.一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣品DNA的作為模板；

(2)加入權(quán)利要求中1的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量PCR反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應(yīng)體系；

(3)將擴增反應(yīng)體系在熒光PCP儀上進行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線判斷樣品中是否為轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)的擴增反應(yīng)體系為：20μL體系為：Premix Ex Taq 10μL，ROXReference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探針Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反應(yīng)程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的步驟(3)的根據(jù)擴增曲線判斷樣品是否為轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的標(biāo)準(zhǔn)為：如果擴增曲線有典型熒光擴增曲線，則說明樣品為轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系；如果擴增曲線無典型熒光擴增曲線，則說明樣品不為轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系。

7.一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的基因組DNA進行梯度稀釋以用作不同起始濃度的模板，分別加入權(quán)利要求1中的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量PCR反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應(yīng)體系，在熒光PCR儀上進行實時熒光PCR反應(yīng)；

(2)反應(yīng)后得到各起始濃度模板對應(yīng)的Ct值，該Ct值與起始濃度的常用對數(shù)(lg)呈線性關(guān)系，據(jù)此得到轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

提取待檢樣品的DNA，加入與步驟(1)中相同體系的上述的檢測引物、檢測探針，與實時熒光定量PCR反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應(yīng)體系，在熒光PCR儀上進行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)后得到Ct值，將其代入轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待檢樣品中轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的含量。