[發明專利]一種耐受有機溶劑漆酶衍生物及其制備方法

在審

• 申請號: 201610854231.8
• 申請日: 2016-09-27
• 公開（公告）號: CN107868790A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 王剛剛
• 申請（專利權）人: 常熟市中科興華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 蘇州睿昊知識產權代理事務所(普通合伙)32277
• 代理人: 伍見

1.一種耐受有機溶劑漆酶衍生物，其特征在于，該耐受有機溶劑漆酶衍生物的突變體為T480A和T480F；

所述T480A的核苷酸序列為SEQ ID NO1；所述T480F的核苷酸序列為SEQ ID NO2。

2.一種由權利要求1所述耐受有機溶劑漆酶衍生物制備的漆酶。

3.一種如權利要求1所述的耐受有機溶劑漆酶衍生物的制備方法，其特征在于，該耐受有機溶劑漆酶衍生物的制備方法包括以下步驟：

引物的設計：把待突變的氨基酸的核苷酸序列換成突變后的核苷酸序列，再加上突變位點前后各6個氨基酸的核苷酸序列組成正向引物，再把正向引物反向互補得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列為SEQ ID NO3；T480A的反向引物核苷酸序列為SEQ ID NO4；T480F的正向引物核苷酸序列為SEQ ID NO5；T480F的反向引物核苷酸序列為SEQ ID NO6；

DpnⅠ酶切消化：分別用正反向引物對pGEX6P-1-CotA質粒進行擴增，擴增條件:94度,5分鐘；94度,1分鐘；68度,30秒；72度,1分鐘；循環30次；72度,5分鐘；冷卻到4度；

將得到的產物用DpnⅠ酶在37℃下酶切5h；

退火：將酶切后產物混合，72℃反應10min后室溫退火；

純化回收：將退火后的產物用試劑盒純化回收；

轉化：將回收產物轉化到感受態DH5α中；

測序：將轉化平板中的菌落送去測序驗證，得到耐受有機溶劑漆酶衍生物的突變體T480A菌株和T480F菌株。

4.如權利要求3所述的耐受有機溶劑漆酶衍生物的制備方法，其特征在于，得到耐受有機溶劑漆酶衍生物的突變體T480A菌株和T480F菌株后還需進行突變體蛋白的純化；突變體蛋白的純化方法包括：

(1)離心收集過夜誘導的菌體，重懸浮于50mMNaCl,25mMTris-HCl pH 8.0的Buffer中，超聲破碎；

(3)將破碎后的菌體12000rpm離心30min，將上清液進行GST親和層析，并在親和柱中加入PPase過夜酶切，以去除融合蛋白中的GST標簽；

(4)將PPase酶切后的突變體蛋白進行Resource Q和Mono Q的離子交換純化。

5.如權利要求4所述的耐受有機溶劑漆酶衍生物的制備方法，其特征在于，

所述突變體蛋白的純化前需進行蛋白的培養；蛋白的培養方法包括：

1)將保存在-80℃的突變體菌株劃線到LB固體平板中，37℃過夜活化；

2)從活化好的固體平板中挑起單菌落于10ml有氨芐抗性的液體LB培養基中，37℃、200rpm過夜活化做種子液；

3)按0.5％的接種量將種子液接種于1L有氨芐抗性的液體LB培養基中，37℃、200rpm培養；

4)當OD600為0.6時，加入IPTG使終濃度為0.2mM，加入硫酸銅使終濃度為0.25mM，18℃、180rpm過夜誘導。