[發明專利]一種耐受有機溶劑漆酶衍生物及其制備方法

在審

• 申請號: 201610854231.8
• 申請日: 2016-09-27
• 公開（公告）號: CN107868790A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 王剛剛
• 申請（專利權）人: 常熟市中科興華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 蘇州睿昊知識產權代理事務所(普通合伙)32277
• 代理人: 伍見

技術領域

本發明屬于醫藥學技術領域，尤其涉及一種耐受有機溶劑漆酶衍生物及其制備方法。

背景技術

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種多銅氧化酶，從底物吸收電子，傳遞給氧氣生成水，具有環保和高效的特點。漆酶底物范圍很廣，包括鄰苯二酚、對苯二酚、多酚、甲氧基替代酚、氮羥基化合物、苯胺和呈現還原性的有機化合物。因為環保高效且具有廣泛的底物譜，漆酶在很多領域都有巨大的應用潛力，如生物修復、生物合成、生成檢測和生物質能源等等。在漆酶催化的反應往往需要在有機介質中進行，一般來說,在有機介質中酶催化反應具有以下優點:(1)增加反應物的溶解度；(2)使反應平衡發生移動；(3)分離簡單。

然而，有機介質往往使漆酶的穩定性和活性較低，因此,需要對野生型漆酶進行改造，篩選耐受有機溶劑的漆酶突變體，

發明內容

本發明的目的在于提供一種耐受有機溶劑漆酶衍生物及其制備方法，旨在解決有機介質使漆酶的穩定性和活性降低的問題。

本發明是這樣實現的，一種耐受有機溶劑漆酶衍生物，該耐受有機溶劑漆酶衍生物的突變體為T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列為SEQ ID NO1；所述T480F的核苷酸序列為SEQ ID NO2。

本發明的另一目的在于提供一種所述耐受有機溶劑漆酶衍生物制備的漆酶。

本發明的另一目的在于提供一種耐受有機溶劑漆酶衍生物的制備方法，其包括以下步驟：

引物的設計：把待突變的氨基酸的核苷酸序列換成突變后的核苷酸序列，再加上突變位點前后各6個氨基酸的核苷酸序列組成正向引物，再把正向引物反向互補得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列為SEQ ID NO3；T480A的反向引物核苷酸序列為SEQ ID NO4；T480F的正向引物核苷酸序列為SEQ ID NO5；T480F的反向引物核苷酸序列為SEQ ID NO6；

Dpn Ⅰ酶切消化：分別用正反向引物對pGEX6P-1-CotA質粒進行擴增，擴增條件:94度,5分鐘；94度,1分鐘；68度,30秒；72度,1分鐘；循環30次；72度,5分鐘；冷卻到4度；

退火：將酶切后產物混合，72℃反應10min后室溫退火；

純化回收：將退火后的產物用試劑盒純化回收；

轉化：將回收產物轉化到感受態DH5α中；

測序：將轉化平板中的菌落送去測序驗證，得到耐受有機溶劑漆酶衍生物的突變體T480A菌株和T480F菌株。

進一步，得到耐受有機溶劑漆酶衍生物的突變體T480A菌株和T480F菌株后還需進行突變體蛋白的純化；突變體蛋白的純化方法包括：

(1)離心收集過夜誘導的菌體，重懸浮于50mMNaCl,25mMTris-HCl pH 8.0的Buffer中，超聲破碎；

(3)將破碎后的菌體12000rpm離心30min，將上清液進行GST親和層析，并在親和柱中加入PPase過夜酶切，以去除融合蛋白中的GST標簽；

(4)將PPase酶切后的突變體蛋白進行Resource Q和Mono Q的離子交換純化。

進一步，所述突變體蛋白的純化前需進行蛋白的培養；蛋白的培養方法包括：

1)將保存在-80℃的突變體菌株劃線到LB固體平板中，37℃過夜活化；

2)從活化好的固體平板中挑起單菌落于10ml有氨芐抗性的液體LB培養基中，37℃、200rpm過夜活化做種子液；

3)按0.5％的接種量將種子液接種于1L有氨芐抗性的液體LB培養基中，37℃、200rpm培養；

4)當OD600為0.6時，加入IPTG使終濃度為0.2mM，加入硫酸銅使終濃度為0.25mM，18℃、180rpm過夜誘導。