[發(fā)明專利]金屬硫蛋白的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610851991.3
• 申請日: 2016-09-27
• 公開（公告）號: CN107056935A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹吉祥
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南米鐸碳新能源科技有限公司
• 主分類號: C07K14/825
• 分類號: C07K14/825;C07K1/14
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務(wù)所37218
• 代理人: 張貴賓

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種金屬硫蛋白的制備方法。

背景技術(shù)

金屬硫蛋白（metallothionein）是由微生物和動、植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白，是一種低分子量、高巰基含量、能大量結(jié)合重金屬離子的蛋白質(zhì)，因此稱為金屬硫蛋白（簡稱MT）。

根據(jù)研究，金屬硫蛋白的重要生理功能表現(xiàn)在它是一種目前已知的最有效的自由基清除劑。其清除氫氧根自由基（?OH）的能力約為SOD的幾千倍，而清除氧自由基（?O）的能力約是谷胱甘肽（GSH）的25 倍，而且具有很強的抗氧化活性；并由此衍生出抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病及帕金森癥等生理功能。金屬硫蛋白在醫(yī)藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。

目前金屬硫蛋白的主要來源為兔肝。由于擔(dān)心人畜橫向傳染疾病，動物源的金屬硫蛋白在歐美地區(qū)已逐步被禁用。因此，開發(fā)更具安全性的植物源的金屬硫蛋白已是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種金屬硫蛋白的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種金屬硫蛋白的制備方法，包括步驟：

A原料準備

1）誘導(dǎo)植物：將誘導(dǎo)劑澆根或噴施于植物葉面，平均劑量控制在5—30毫克/千克干基植物；連用5—20天，隔天施用1次，每次劑量較上一次高0.3—3倍；

2）將上述誘導(dǎo)后的植物經(jīng)除雜、揉絲、切段、干燥、粉碎后置入汽爆罐中，粉末加入量達到罐體容積的5—40%，用空壓機緩緩?fù)ㄈ攵栊詺怏w排凈罐內(nèi)空氣后封閉；不斷加壓至1—5MPa，保壓20—120分鐘；噴放到密封噴放倉，得汽爆粉末；充入惰性氣體保存、備用；

B金屬硫蛋白的制備

3）汽爆粉末入提取罐中，加入1—20倍體積的Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的質(zhì)量濃度為0.01~0.1mol/L，用空壓機通入惰性氣體，攪勻后，提取10—60分鐘；

4）將步驟3）中提取罐內(nèi)的混合溶液離心分離，取上清；靜置1—3小時，澄清處理，然后通過超濾、納濾分離系統(tǒng)，得到分子量介于10000至15000道爾頓的金屬硫蛋白粗液；

5）將上述金屬硫蛋白粗液移入酶解罐，加入常溫型α-淀粉酶，間歇1分鐘，通入惰性氣體1分鐘；酶解10—80分鐘；所述常溫型α-淀粉酶由微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌分泌所得α-淀粉酶，所述常溫型α-淀粉酶的適宜溫度為22-35℃；

6）將步驟5）酶解后的液體移入冷凍離心機高速離心，取上清；

7）將上清直接上Sephadex G-50柱層析進行分離，以0.005~0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集含金屬硫蛋白組分的洗脫液；

8）將步驟7）中收集的洗脫液進行真空濃縮，濃縮后的剩余部分用Tris-HCl緩沖液洗滌1~5遍，重復(fù)本步驟，得金屬硫蛋白；經(jīng)干燥、粉碎后得金屬硫蛋白成品。

其中，選取的誘導(dǎo)植物為灌木、小喬木、大葉作物、瓜秧等；瓜秧包括其莖、葉。

進一步，步驟1）中所述誘導(dǎo)劑為金屬鹽類水溶液，誘導(dǎo)劑水溶液質(zhì)量濃度為10—50%。

步驟1）中所述誘導(dǎo)劑包括銅、鐵、鋅、錳的硫酸鹽、硝酸鹽或氯化物中的一種或多種混合物。

其中，步驟5）中，所述微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌的獲取步驟具體為：將地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)液置于微波發(fā)生器，設(shè)置微波功率為850-950W，脈沖頻率為2300MHz，微波處理20s，冷卻20s，依此往復(fù)25-35次；將微波處理后的培養(yǎng)液涂布在固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)1-2天，由存活下來的菌落中篩選四株常溫下α-淀粉酶活性高的地衣芽孢桿菌的變異菌株。

選出常溫下α-淀粉酶性最高的地衣芽孢桿菌的變異菌株擴大培養(yǎng)，從而獲得所述常溫型α-淀粉酶。

上述所述常溫型α-淀粉酶的加入量滿足每升金屬硫蛋白粗液30-70U。

進一步，所述惰性氣體為氮氣、氦氣或氬氣。

進一步，所述Tris-HCl緩沖液pH6~10。

進一步，步驟8）中所述干燥為噴霧干燥、熱風(fēng)干燥、流化床干燥或冷凍干燥。

本發(fā)明的有益效果為：