[發(fā)明專利]金屬硫蛋白的制備方法

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• 申請日: 2016-09-27
• 公開（公告）號: CN107056935A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 曹吉祥
• 申請（專利權）人: 濟南米鐸碳新能源科技有限公司
• 主分類號: C07K14/825
• 分類號: C07K14/825;C07K1/14
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所37218
• 代理人: 張貴賓

1.一種金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于，包括步驟：

A原料準備

1）誘導植物：將誘導劑澆根或噴施于植物葉面，平均劑量控制在5—30毫克/千克干基植物；連用5—20天，隔天施用1次，每次劑量較上一次高0.3—3倍；

2）將上述誘導后的植物經除雜、揉絲、切段、干燥、粉碎后置入汽爆罐中，粉末加入量達到罐體容積的5—40%，用空壓機緩緩通入惰性氣體排凈罐內空氣后封閉；不斷加壓至1—5MPa，保壓20—120分鐘；噴放到密封噴放倉，得汽爆粉末；充入惰性氣體保存、備用；

B金屬硫蛋白的制備

3）汽爆粉末入提取罐中，加入1—20倍體積的Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的質量濃度為0.01~0.1mol/L，用空壓機通入惰性氣體，攪勻后，提取10—60分鐘；

4）將步驟3）中提取罐內的混合溶液離心分離，取上清；靜置1—3小時，澄清處理，然后通過超濾、納濾分離系統(tǒng)，得到分子量介于10000至15000道爾頓的金屬硫蛋白粗液；

5）將上述金屬硫蛋白粗液移入酶解罐，加入常溫型α-淀粉酶，間歇1分鐘，通入惰性氣體1分鐘；酶解10—80分鐘；所述常溫型α-淀粉酶由微波誘導所得變異地衣芽孢桿菌分泌所得α-淀粉酶，所述常溫型α-淀粉酶的適宜溫度為22-35℃；

6）將步驟5）酶解后的液體移入冷凍離心機高速離心，取上清；

7）將上清直接上Sephadex G-50柱層析進行分離，以0.005~0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集含金屬硫蛋白組分的洗脫液；

8）將步驟7）中收集的洗脫液進行真空濃縮，濃縮后的剩余部分用Tris-HCl緩沖液洗滌1~5遍，重復本步驟，得金屬硫蛋白；經干燥、粉碎后得金屬硫蛋白成品。

2.如權利要求1所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：選取的誘導植物為灌木、小喬木、大葉作物、瓜秧等。

3.如權利要求1所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：步驟1）中所述誘導劑為金屬鹽類水溶液，誘導劑水溶液質量濃度為10—50%。

4.如權利要求1所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：步驟1）中所述誘導劑包括銅、鐵、鋅、錳的硫酸鹽、硝酸鹽或氯化物中的一種或多種混合物。

5.如權利要求1所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：步驟5）中，所述微波誘導所得變異地衣芽孢桿菌的獲取步驟具體為：將地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)液置于微波發(fā)生器，設置微波功率為850-950W，脈沖頻率為2300MHz，微波處理20s，冷卻20s，依此往復25-35次；將微波處理后的培養(yǎng)液涂布在固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)1-2天，由存活下來的菌落中篩選四株常溫下α-淀粉酶活性高的地衣芽孢桿菌的變異菌株。

6.如權利要求5所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：選出常溫下α-淀粉酶活性最高的地衣芽孢桿菌的變異菌株擴大培養(yǎng)，從而獲得所述常溫型α-淀粉酶。

7.如權利要求5或6所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：所述常溫型α-淀粉酶的加入量滿足每升金屬硫蛋白粗液30-70U。

8.如權利要求1所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：所述惰性氣體為氮氣、氦氣或氬氣。

9.如權利要求1所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：所述Tris-HCl緩沖液pH6~10。

10.如權利要求1所述金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于：步驟8）中所述干燥為噴霧干燥、熱風干燥、流化床干燥或冷凍干燥。