[發(fā)明專利]一種評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞骨吸收功能的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610840447.9
• 申請(qǐng)日: 2016-09-21
• 公開（公告）號(hào): CN106282297B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 漆祎鳴;胡予;任衛(wèi)英;陸逸;沈志云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 上海卓陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

1.一種評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞骨吸收功能的方法，其特征在于，所述的方法是將長(zhǎng)徑小于30μm的骨粉固定于細(xì)胞培養(yǎng)板的底面，通過對(duì)培養(yǎng)前后定點(diǎn)照片的光密度分析，比較培養(yǎng)前后細(xì)胞培養(yǎng)板的透光度，從而反映細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)骨粉被吸收的程度，以評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞的骨吸收功能；所述的方法包括以下步驟：

a)制板：將長(zhǎng)徑小于30μm的骨粉進(jìn)行滅菌，加入酒精溶液制成骨粉混懸液，充分混勻后滴加至細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，然后將加好的細(xì)胞培養(yǎng)板晾干，再向孔內(nèi)加入丙酮，所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為(10-30)μl:1.75cm²，滴入丙酮后迅速翻轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)板，1-10min之內(nèi)在孔底做標(biāo)記，待孔底完全凝固后用蒸餾水沖洗，將未固定在孔底的骨粉沖洗干凈，晾干；

b)培養(yǎng)前拍照：用顯微鏡于標(biāo)記位置拍照，同時(shí)選取一個(gè)不做任何處理的孔作為校正孔進(jìn)行拍照，以用于校正培養(yǎng)后拍照時(shí)因顯微鏡參數(shù)不一致而產(chǎn)生的誤差；

c)細(xì)胞的接種和培養(yǎng)：在上述細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，接種濃度為(0.5-1.5)*10⁵個(gè)/ml，培養(yǎng)時(shí)間為8-14d；

d)培養(yǎng)后拍照：培養(yǎng)結(jié)束后除去細(xì)胞及殘留核酸，待細(xì)胞培養(yǎng)板晾干后再次對(duì)標(biāo)記位置和校正孔進(jìn)行拍照；

e)照片對(duì)比：對(duì)培養(yǎng)前后兩次照片進(jìn)行光密度分析，比較細(xì)胞培養(yǎng)前后細(xì)胞培養(yǎng)板的透光度，從而反映細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)骨粉被吸收的程度；

所述酒精溶液的體積濃度為70％-90％，所述骨粉混懸液的濃度在2.5mg/ml以上。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中，所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為10μl:1.75cm²。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d)中，除去細(xì)胞的方法是采用EDTA配制的0.25％胰酶消化10-20min，再使用強(qiáng)RIPA裂解10-20min；或直接使用強(qiáng)RIPA裂解15-30min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d)中，除去殘留核酸的方法是先采用0.5-5mol/L的NaCl溶液清洗，再使用蒸餾水清洗。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的骨粉由牛股骨皮質(zhì)制成。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中，是使用微量移液器的槍頭在孔底做標(biāo)記。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中，是在10×光鏡下拍照。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e)中，所述的光密度分析具體是使用軟件分析培養(yǎng)前后兩次照片的總光密度值，除以整張照片的面積，算出平均光密度值，再利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正培養(yǎng)后拍照所有照片的平均光密度值，校正后的培養(yǎng)后照片的平均光密度值與培養(yǎng)前照片的平均光密度值的差值即反映培養(yǎng)板上骨粉減少的量。