[發明專利]一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法

有效

• 申請號: 201610840447.9
• 申請日: 2016-09-21
• 公開（公告）號: CN106282297B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 漆祎鳴;胡予;任衛英;陸逸;沈志云
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

本發明提供了一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法，所述方法是將長徑小于30μm的骨粉固定于細胞培養板的底面，通過對培養前后定點照片的光密度分析，比較培養前后細胞培養板的透光度，從而反映細胞培養板內骨粉被吸收的程度，以評價破骨細胞的骨吸收功能。本發明的方法更加簡便，克服了破骨細胞選擇性吸附的問題，結果更加穩定、可靠，具備良好的可操作性和較高的靈敏度，在破骨細胞溶骨活性檢測相關的研究中具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法及其應用。

背景技術

骨質疏松是目前老齡化社會的常見病和多發病。骨質在新陳代謝的過程中不斷的通過合成和降解進行重建，該過程由成骨細胞和破骨細胞共同作用來完成。破骨細胞在骨質代謝過程中具有十分重要的作用，其功能的過度激活在骨質疏松的發生和發展上有著較為直接的作用。破骨細胞的體外實驗在骨質疏松的發病機制和治療方式的研究中有著極為重要的作用。其中，對破骨細胞溶骨活性的評價，經常作為各種干預因素處理后的觀察指標，在此類研究中有著不可或缺的作用。

在既往的研究中，對破骨細胞功能的評價主要集中在三個方面。第一，通過檢測破骨細胞溶骨后的代謝產物，如NTX-I、CTX-I和ICTP；第二，通過檢測破骨細胞內特異性酶的含量和活性，如TRAP染色和組織蛋白酶K活性的檢測；第三，通過將破骨細胞與骨片進行共培養，使用顯微鏡觀察骨片上破骨細胞吸收陷窩的個數、面積以及深度，來評價破骨細胞的功能。

以上方法中，第一、二種方法是對破骨細胞功能的間接反映，可通過該指標推測破骨細胞的功能，但影響結果的因素較多，準確性相對較差。第三種方法可以直接的反映破骨細胞的溶骨功能，并可以通過對吸收陷窩的個數、面積以及深度差異的分析，比較溶骨功能的強弱，是目前使用較為廣泛，結果也較為準確的方法，但該方法在使用的過程中存在較大的限制。第一，骨片的制備。骨片制備的困難是限制該方法使用的重要原因。以使用牛骨制備骨片為例，首先需將牛股骨洗凈，刮除表面肌腱、韌帶和內面的骨髓，將骨皮質縱行切開，用骨皮質制成一條圓柱形骨棒。然后使用重型切片機，將骨棒切成100μm左右的骨薄片并用剪刀將其剪切到目的大小，最后將骨薄片磨成10～50μm后置于75％酒精或者雙抗中備用。其中，骨片的打磨過程困難，成功率較為有限，使骨片的大量制備可行性不高。同時，國內重型切片機的缺乏也是一個重要的限制。此外，受骨皮質厚度的限制，骨棒的直徑一般為10mm左右，因此只適用于48孔或者96孔細胞培養板。第二，骨片的使用。骨片在使用過程中，首先遇到的問題是無法承受高溫滅菌，只能通過酒精或著雙抗浸泡和紫外線照射的方法滅菌，培養時污染的可能性相對增加。其次，由于破骨細胞有著趨于遠離骨片的特性，使得其不易附著于骨片表面，而常常聚集在骨片周圍和骨片下。又由于人工剪切骨片的水平有限，并不能使骨片和培養孔的大小十分一致。因此，種植在骨片上的細胞數量，很大程度上取決于滴加細胞時的位置和液體流速，而骨片的不透明又限制了對細胞的計數。第三，結果的分析。由于骨片上細胞數的不一致，使得用于功能比較時，基線的可比性大大降低。而骨片上細胞分布的不一致，使得在觀察結果時，很大程度上取決于視野的選取。

基于以上原因，目前為止，沒有一種較好的方法可以檢測破骨細胞的溶骨活性，極大限制了對影響破骨細胞功能因素的研究。因此，本領域亟需開發一種簡單易行并且準確性較高的實驗方法，以評價破骨細胞的溶骨活性。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法，所述的方法是將長徑小于30μm的骨粉固定于細胞培養板的底面，通過對培養前后定點照片的光密度分析，比較培養前后細胞培養板的透光度，從而反映細胞培養板內骨粉被吸收的程度，以評價破骨細胞的骨吸收功能。

優選地，所述的方法包括以下步驟：