[發明專利]用于檢測轉基因大豆的引物和探針組合、檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201610834257.6
• 申請日: 2016-09-20
• 公開（公告）號: CN107868838A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 趙暉;乾義柯;魏霜;鄭劍
• 申請（專利權）人: 湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，特別涉及檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的雙重熒光PCR方法。

背景技術

2015年是轉基因作物商業化20周年，全球轉基因作物種植面積高達1.797億公頃，比1996年商業化初期增長了100余倍，已成為現代農業史上采用最為迅速的作物技術。目前商業化種植的轉基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜等，其中全球種植面積最大的為轉基因大豆，約占全球轉基因作物總面積的一半。雖然我國還沒有批準任何轉基因大豆品系進行商業化種植，但我國已經成為轉基因大豆的使用與消費大國，產品越來越多地進入了我國的食品生產與消費鏈，2015年轉基因大豆的進口總量已達到8000萬噸。

轉基因大豆DAS81419是由美國陶氏益農研發的一種轉基因大豆品系，含有兩個抗蟲基因Cry1Ac、Cry1F和一個抗除草劑基因pat，2014年美國和加拿大批準環境釋放作為食品和飼料應用，但目前還沒有獲得我國轉基因生物安全證書。2015年，中國進口大豆8169萬噸，是全世界最大的大豆進口國，其中大部分為轉基因大豆，主要來源于美國和巴西。然而，目前我國沒有建立用于檢測轉基因大豆DAS81419的國家標準和出入境檢驗檢疫行業標準，這不利于口岸實驗室開展非法轉基因品系的把關檢測。因此，建立轉基因大豆DAS81419的檢測方法具有相當的意義。

目前，國內外針對轉基因大豆的檢測方法多采用單重熒光PCR技術，該技術在特異性、靈敏度、重現性等方面具有較大的優勢，成為該領域的主要技術之一，但國內針對轉基因大豆DAS81419品系的檢測鮮有報道，而且目前還沒有能同時檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的多重熒光定量PCR技術的方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏、準確、高效且能同時檢測檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的雙重熒光PCR方法，本發明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測效率高和適用范圍廣的引物對和探針組合，以及含有該引物對和探針組合的試劑盒及其應用。

為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：

引物對和探針組合，其特征在于，所述引物對和探針組合包括第一組引物對、第二組引物對、第一探針和第二探針，所述第一組引物對包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第一探針與所述第一組引物對相對應，所述第一探針包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述第二組引物對包含SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述第二探針與所述第二組引物對相對應，所述第二探針包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

另一方面，本發明提供了所述的引物對和探針組合在檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因，或制備檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的產品中的應用。

本發明還提供了一種用于對轉基因大豆進行檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物對和探針組合。

優選地，所述試劑盒還包括：

熒光定量PCR擴增試劑，所述熒光定量PCR擴增試劑包括dNTPs、Mg²⁺、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合酶，所述dNTPs、Mg²⁺、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合酶均來源于Takara公司的貨號為RR390A的試劑盒中所包含的試劑；

所述試劑盒還包括DNA提取試劑，所述DNA提取試劑包括來自達安基因的貨號為DA-Z146的核酸提取試劑、Promega公司的貨號為A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的貨號為9781的MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit中所包含的試劑；

所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。

需要說明的是，這里所提到的“所述試劑盒還包括DNA提取試劑”指的是，本發明的試劑盒中還包含DNA提取試劑盒中的相應成分或試劑，DNA提取試劑盒可以根據需要獨立地存在或者包含在本發明的試劑盒內。

另一方面，本發明提供所述的試劑盒在檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因，或制備檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的產品中的應用。

另一方面，本發明提供一種檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的雙重熒光PCR方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：